核酸分离、纯化原则和要求

为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中应注意以下事项：

①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。

②减少化学因素对核酸的降解，要避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH=4～10的条件下进行。

③减少物理因素对核酸的降解。物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式破裂以及DNA样本的反复冻贮等，都有可能造成DNA链的断裂。机械剪切作用的主要危害对象是大分子线性DNA，如真核细胞的染色体DNA。对小分子的环状DNA，如质粒DNA及RNA，机械剪切作用的威胁相对小些。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取一般在低温条件下进行，但现在发现在室温快速提取与低温提取获得的核酸的质量没有太大差异。

④防止核酸的生物降解。细胞内的或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，其中DNase需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，使用EDTA、柠檬酸盐钠，基本可以抑制DNase酶活性。RNase不但分布广泛，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，极易污染样品，是RNA提取过程的主要危害因素。降低温度、改变酸碱度及盐的浓度都有利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，几种条件并用更好。

对于DNA的提取，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA的提取，因RNA分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更为重要。