影响PCR的因素
影响PCR的因素很多，包括PCR体系的组成成分和PCR反应条件。
1.模板
模板DNA的量与纯度，是PCR成败的关键因素之一。模板中过多的蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应；模板降解会导致PCR扩增无产物；添加过多的模板容易导致非特异性扩增产物的增加，模板过少会导致扩增产物量低。
2.引物
PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度，理论上只要知道一段模板DNA序列，就能设计出互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
PCR产物的特异性是由引物决定的，要获得比较高的特异性，对引物有一些要求：①引物的长度一般为16～30 bp，太长不仅会浪费，而且最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度；太短不能保证PCR扩增产物的特异性。②（G+C）%含量为40%～60%，（G+C）%含量太少扩增效果不佳，（G+C）%过多易出现非特异条带。③3′端最好是G或C，但不要3个以上的连续G或C。④酶切位点可以加在引物的5′端，另外加上2～3个保护碱基。⑤引物的退火温度（T m）决定了PCR的退火温度，两条引物的退火温度相差一般不超过5℃，退火温度可以用公式T m=4（G+C）+2（A+T）进行粗略的估算。⑥兼并引物的设计要尽量使用简并低的密码子。⑦内部不要存在反向重复序列，以避免两条引物间互补，特别是3′端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带。⑧引物扩增跨度为0.5～5 kb时，扩增较容易，特定条件下可扩增至10 kb以上的片段。⑨引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性，可以提纯在NCBI的primer blast中分析。⑩引物添加量以最低引物量产生所需要的结果为好，浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
3.dNTP的浓度
PCR反应体系中dNTP的浓度一般为50～400μmol/L，较多地使用200μmol/L，dNTP浓度过高会抑制DNA聚合酶的活力，浓度过低会影响PCR的产量。4种dNTP浓度一般是相等的，浓度相差太大会引起错误掺入。
4.Mg2+浓度
Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L。Mg2+的浓度对DNA聚合酶的影响很大，它能够影响酶的活力和忠实性，影响引物的退火温度和产物的特异性。提高Mg2+浓度，会降低反应特异性，容易出现非特异扩增；降低Mg2+浓度会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。如果PCR反应对特异性要求较高，最好进行优化实验来确认最佳的Mg2+浓度。
5.反应缓冲液
不同商品的耐热DNA聚合酶都配有特定的反应缓冲液，一般不混用。有些酶的反应缓冲液已经包含Mg2+，使用时不用再额外添加；有的缓冲液不包含Mg2+，使用时可以根据自己的实际需要来添加。反应缓冲液的工作浓度一般是1。虽然反应缓冲液在0.5～2.5的工作浓度都能进行PCR反应，但使用过低或过高浓度的反应缓冲液都会降低PCR扩增能力。
6.DNA聚合酶
DNA聚合酶的耐热性影响PCR的产量，不同来源的酶扩增特性（包括扩增效率和忠实性）差异很大。一般来说，总反应体积为100μL的PCR反应约需酶量2.5 U，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
现已商品化的耐热DNA聚合酶主要有Taq、ULTma、Tth、pfu、Tli Hot、Tub、Tf l、Tbr等DNA聚合酶。耐热DNA聚合酶通常保存于一定浓度的甘油中。不同的耐热DNA聚合酶有不同的特性，有些具有3′→5′的外切酶活性，所以其扩增产物是平末端的；有些不具有3′→5′的外切酶活性，所以能形成带一个突出A的扩增产物。前者不能用T载体来克隆PCR产物，而后者则可以。不同的耐热DNA聚合酶具有不同的保真性，有些保真性高，有些保真性低。耐热DNA聚合酶的用量要根据其使用说明书决定，过量的酶不仅造成浪费，而且会带入过量的甘油，影响PCR的结果。不同的耐热DNA聚合酶商品中虽然基本成分都相似，但是附加的成分会有很大的差异：不同的酶可能会添加BSA、Tween-20、NP-40、Triton X-100等，而且盐浓度、酸碱度、二价阳离子等都会有一定的差异。
7.PCR辅助剂
在常规PCR体系中可以添加DMSO（1%～10%）、PEG6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、甲酰胺（1%～10%）、非离子去污剂和牛血清蛋白等PCR辅助剂，这些辅助剂也叫增强剂，它们可以提高PCR的特异性和产量，而且有些PCR反应只能当这些辅助剂存在时才能扩增出目的片段。添加PCR辅助剂可以降低模板和引物的退火温度，但添加量过多会导致PCR扩增产量降低。加入10%的DMSO有利于减少DNA的二级结构，使（G+C）%含量高的模板易于完全变性；在反应体系中加入DMSO可使PCR产物直接测序更易进行，但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性。一些商品化的试剂盒之所以获得很好的扩增效果，除PCR基本组分得到很好的优化外，一般都是因为PCR增强剂。