四、长片段PCR

长片段PCR（long distance-PCR）也称大片段PCR，一般是指扩增产物的长度超过10 kb以上的PCR反应。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长的目的片段（大于5 kb），可能是因为其缺少3′—5′外切酶活性，不能纠正dNTP错误掺入，错误配对使产物的延伸概率大大降低，减少了较长产物的产量。Pfu DNA聚合酶具有完整的3′—5′外切酶校读活性，可以将每个循环中碱基的错配率由10-4降到10-3，从而提高PCR产物的准确性。但在实际应用中Pfu DNA聚合酶在扩增1.5～2.0 kb片段时，扩增效率比其他类型的聚合酶差，在扩增5.0～7.0 kb片段时亦不比其他类型的聚合酶有明显优越之处，因而以往的PCR反应产物限制在5.0 kb以内，超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。所以，一般的PCR方法都存在扩增产物保真度和合成片段的大小两个方面的局限性。

大片段PCR的主要策略有：第一，利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增；第二，控制脱嘌呤反应以增强扩增效率。Pfu DNA聚合酶虽然可以通过3′—5′外切酶活性功能纠正错配的碱基，但也可能降解引物，尤其是在较长反应时间下和酶浓度较高时，反应效果更差。因此必须将Pfu DNA聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用Klen Taq DNA聚合酶或其他类型的耐热DNA聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klen Taq DNA聚合酶催化的延伸反应顺畅进行。已有实验证实，按15∶1的比例混合使用Klen Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶，引物大小为27～33 bp，可有效地扩增10～15 kb的DNA片段。对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。

在PCR反应体系中DNA聚合酶的热稳定性一般都是较好的，但其某些成分耐热性较差，会影响反应效率，究其原因可能是在温度较高的环境中，模板DNA的某些位点发生了脱嘌呤反应，阻碍了反应的顺利进行。Lindahl和Nyberg的研究结果显示：在70℃、pH=7.4的条件下，单链DNA脱嘌呤反应的速度是双链DNA的4倍；在100℃、pH=7.0时，100 kb的碱基中每分钟将有1个位点脱嘌呤。这一反应与缓冲体系中酸碱度的变化有关。Tris的酸解离常数（p K a）会随温度升高而改变，平均每升高1℃，p K a降低0.03。因而，25℃的pH=8.55的PCR反应体系，到95℃热变性时，pH值将变为6.45，这就很可能诱导脱嘌呤反应。

为了控制脱嘌呤反应，增强扩增效率，可以采取下列措施：①缩短热变性时间，有学者在扩增35 kb的大片段时，变性温度为95℃，时间为5 s，取得满意结果；②尽可能使升温、降温过程缩短，可选择使用导热性能优越的薄壁反应管及较为先进的扩增设备；③适当提高反应体系的pH值，反应最初应将pH值控制在8.8～9.2；④适当增加延伸时间（可长至20 min）。使用这种方法可以扩增最大为35 kb的DNA片段，产物的准确性亦有充分保证。

一般来说，高质量的模板DNA、合适的引物、合适的PCR反应体积（20～50μL），都有利于提高长片段PCR的扩增效率。此外不同的DNA聚合酶扩增产物的长度差异很大，Tth DNA聚合酶用于大片段扩增比天然Taq DNA聚合酶更容易获得较稳定扩增结果，Hot Tub DNA聚合酶亦可用来扩增6～15.6 kb的DNA，而有3′—5′外切酶活性的Pfu DNA聚合酶及Vent DNA聚合酶则一般不能扩增大于6 kb的DNA片段。

随着DNA重组技术和酶工程的发展，目前有些商品的DNA聚合酶扩增大片段的能力已经得到提高，可以扩增超过35 kb的DNA片段，也有一些专门针对扩增大片段的PCR试剂盒，可以根据实验的需要来进行选择。