核酸酶的抑制和抑制剂

二、核酸酶的抑制和抑制剂

核酸提取过程中对核酸酶的抑制是关键,不同来源的核酸酶,其专一性、作用方式都有所不同,因此应根据降解核酸的类型选择不同的核酸酶抑制剂。按抑制核酸的类型不同,核酸酶抑制剂可以分为两大类。

1.DNA酶(DNase)抑制剂

DNase比较容易失活,其活性需要Mg2+、Ca2+等金属二价离子激活,加入少量金属离子螯合剂,如0.01 mol/L的EDTA或柠檬酸钠就可以让DNase基本失活。此外,表面活性剂、去垢剂等蛋白变性剂也可使DNase失活,常用于提取DNA的有十二烷基硫酸钠(SDS)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

SDS能使蛋白质变性,解聚细胞中的核蛋白,并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物,该复合物在高盐溶液中形成沉淀。

CTAB是一种阳离子去污剂,在DNA提取中,其作用是使蛋白质变性,让DNA被释放出来。CTAB能与核酸形成复合物,该复合物可溶,能稳定存在于高盐浓度下(>0.7 mmol/L NaCl),但在低盐浓度(如0.1~0.5 mmol/L NaCl)下,CTAB核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后,加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。因此在利用CTAB法提取DNA时,要用NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,在液体环境中,CTAB同时溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离。经离心弃上清液后,CTAB—核酸复合物用70%~75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB,再通过氯仿/异戊醇(24∶1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

2.RNA酶(RNase)抑制剂

RNase分布广泛,极易污染样品,而且耐高温、耐酸、耐碱,不宜失活。RNase的抑制和失活是RNA提取的关键。

常用的RNase抑制剂有:皂土、焦磷酸二乙酯(DEPC)、肝素、复合硅酸盐(Iacaloid)、RNase阻抑蛋白(RNasin)、氧钒核糖核苷复合物(vanadyl-ribonucleosidecomplex,VRC)及一些强烈的蛋白酶变性剂,如胍盐、氯化锂等。

DEPC是一种强烈但不彻底的RNase抑制剂,它通过与蛋白质中的组氨酸的咪唑环结合,使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。

异硫氰酸胍目前被认为是最有效的RNase抑制剂之一,异硫氰酸胍有破坏细胞结构、能使核酸从核蛋白中解离出来,并对RNase有强烈的变性作用。异硫氰酸胍与β-巯基乙醇(破坏蛋白质的二硫键)合用可使RNase被极度抑制。盐酸胍有时也用作RNase抑制剂,但它是一个核酸酶的强抑制剂,并不是一种足够强的变性剂,可以完整地将RNA从富含RNase的组织中提取出来。

氧钒核糖核苷复合物是由氧钒(Ⅳ)离子和4种核糖核苷中的任意一种所形成的复合物,都是过渡态类似物,能与多种RNase结合并几乎百分之百地抑制RNase的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中,在RNA提取和纯化的所有过程中,其使用浓度都是10 mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译,并能作为某些细胞外酶促反应(如mRNA反转录)的模板。然而氧钒核糖核苷复合物会强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译,因此必须用苯酚多次提取以除之。

RNase的蛋白质抑制剂(RNasin)是从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白,是RNase的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNase结合,使其失活。

Macaloid(硅藻土)是一种黏土,很多年前就发现它能吸附RNase,用缓冲液将其制成浆液,以0.015%(m/V)的终浓度溶解细胞。这种黏土随同它所吸附的RNase可在后续的RNA纯化过程中(如酚抽提后)经离心去除。