PCR技术的原理

PCR技术的基本原理与生物体内合成DNA的模式相似，在体外设计、合成引物，然后以总DNA为模板，将其与引物、一定量的4种dNTP混合，加入耐热的DNA聚合酶及所需辅助试剂构成扩增系统，进行循环反应。所以PCR实际上是模拟生物体内DNA聚合酶合成DNA的过程。

生物体内合成DNA的步骤是变性、复性、半保留复制。PCR中则由高温变性、低温退火及适温延伸三个基本步骤组成一个循环，一般进行25～40次循环，使目的基因在数小时乃至几十分钟内迅速扩增。①高温变性。在高温（92～98℃）下使待扩增的DNA解链成为单链模板。②低温退火。引物在低温（38～65℃）下分别与模板两条链的3′-OH端互补结合，形成局部双链区。③适温延伸。引物和模板DNA完成退火后，DNA聚合酶开始起作用，在适当温度（68～72℃）下将dNTP从引物的3′端掺入，沿引物5′—3′方向延伸，合成一条与模板互补的新链DNA。至此完成了PCR的第一次循环，继之再进行第二次循环。在第二次循环中，第一次循环得到的DNA扩增链也作为模板与引物片段杂交。由于引物和dNTP都是过量的，加入的DNA聚合酶是耐高温的，所以在以后的各轮循环中不需加入任何其他试剂，反应在热循环仪上自动进行。高温变性—低温退火—适温延伸，如此循环反复，每一次循环产生的新链DNA均能成为下次循环的模板，故PCR产物是以指数方式，即2n方式扩增。

需要注意的是，PCR第一次循环没有目的DNA片段出现，在第二次循环得到单链的目的DNA片段，第三次循环才能得到双链的目的DNA片段。

PCR仪是自动化热循环仪，它可以根据反应条件的要求，精确设置反应管加热或冷却到每步反应所需的温度。PCR的灵敏度高，对PCR结果的重复性要求也很高。实现PCR重复扩增需要满足两个条件：第一，是对自动化热循环仪的要求——要求仪器有优良的热均匀性，温度控制的精度高，加热和冷却的速度快，仪器的重复性和可靠性高；第二，是对操作人员的要求——扩增体系的物理尺寸要合理，操作要规范。