基因编辑的执行手段
1.基因敲除
基因编辑在利用CRISPR/Cas9做基因敲除时，sgRNA的选择至关重要。要破坏一个基因的功能，理想的情况是在基因编码重要功能域的位点设计sgRNA，但是大多数情况下研究者不知道此段基因编码了哪些重要功能域。在编码区的最前端接近起始密码子ATG的区域设计sgRNA进行编辑，移码突变会造成整个基因无法表达。但是有些情况下，这个基因会从后面的ATG开始表达，表达出来的蛋白依然能够行使功能。如果编辑的位点过于靠近编码区的后端，那么前面很长的蛋白就会被表达，就可能依然保留其功能。Doench等通过分析多个基因发现，在编码区起始位点长度的5%～65%区域内设计sgRNA可以最大可能地敲除基因。有些基因包括多个转录本，要把sgRNA设计在它们共同的区域，才能敲除所有的转录本，注意不要把sgRNA设计在基因的内含子区，要根据编码区进行设计。编码区是多个外显子拼接在一起的序列，sgRNA不要跨在两个外显子上，因为研究者最终编辑的是基因组DNA，两个外显子在基因组上是被内含子分开的，跨两个外显子的sgRNA序列在基因组中是不存在的。
2.调控CRISPR/Cas9系统
在研究中有时需要对Cas9的表达进行精确调控，从而阐明特定时间内的基因在生物体中的功能；有时还需要在特定的组织或者器官中表达Cas9，以阐释组织特异性的基因在个体发育中的功能。基于上述需求，科学家们开发出了多西环素诱导的CRISPR/Cas9系统，在小鼠以及人类胚胎干细胞（hES）中实现了对Cas9表达的时间控制。有研究者将Cas9蛋白分成两个失活的片段，并且分别连接上光控蛋白，当蓝光照射时，两个光控蛋白连接到一起，Cas9核酸酶功能随之恢复，停止光照，Cas9蛋白会再度分开，这样就可以通过光照从时间和空间上对内源基因的表达进行调控。
3.基因敲入
基因敲入是经常要用到的一项重要技术，比如要研究患者携带的基因突变是否具有致病性，就需要将这个点突变引入细胞或动物中制作模型；要研究一个基因在哪个组织中表达，就需要在这个基因上面连上GFP报告基因。在做基因敲入时，需要将一个与编辑位点同源的DNA供体和CRISPR/Cas9共同转染到细胞中，细胞内的修复系统修复DNA双链断裂时，会将供体上携带的点突变或者转基因拷贝到双链断裂处。这个供体模板可以是质粒DNA，也可以是单链Oligo DNA。利用质粒DNA作供体时，敲入的效率比较低，需要在供体上加入标记基因，标记基因与点突变一同被引入到基因组上，通过药物筛选或者流式分选的方法将敲入的细胞筛选出来，这样效率就大大提高了。编辑完成后，标记基因需要移除以免影响基因表达。移除的方法是设计时在标记基因的两端加上LoxP位点，在细胞中瞬时表达Cre重组酶就可以去除标记基因了。去除后，基因组中会留下一个34 bp的LoxP位点，所以设计的时候需要把标记基因及LoxP位点放在内含子区。因为转染效率，不是所有的细胞都会去除标记基因。所以一般都用嘌呤霉素抗性基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）融合的基因作为标记基因，嘌呤霉素抗性基因用作正向筛选，HSV-tk在去除标记基因时用作负向筛选，加上更昔洛韦就可以杀死含有标记基因的细胞。用质粒DNA作供体的优点是：可以将大片段的转基因敲入细胞中，经过筛选后效率很高，缺点是：构建载体比较麻烦，而且需要两步（敲入和去除标记基因）才能得到细胞系。
单链DNA也可以作为基因敲入的供体。单链DNA供体在DSB两边的同源臂长度以40～50 bp为佳。利用单链DNA可以把点突变和短的DNA序列整合到基因组中，但它无法将较大的基因敲入基因组，因为目前Oligo合成的长度一般少于150 bp。单链DNA比较短，容易大量转入细胞中，在一些实验中取得了较高的敲入效率，最高可达60%。单链DNA合成成本低、速度快，编辑完成后不需要去除标记基因，但这种方法也有明显的局限，即突变的敲入效率受CRISPR/Cas9切割位点的影响，单链DNA上的突变位点与切割位点小于10 bp才能实现有效的敲入，很多情况下找不到理想的切割位点。敲入效率也受细胞类型的影响，很多情况下效率太低难以筛选到阳性克隆。有研究表明，加入DNA ligase IV的抑制剂Scr7可以提高同源重组的效率，DNA ligase IV是NHEJ途径的关键酶，抑制了NHEJ途径就会促进HR途径，但每种细胞对Scr7浓度的耐受程度不同，提高的效率也相差很大，从二三倍至十几倍，需要花时间摸索最佳的条件，所以很少有人使用。另外，NHEJ途径被Scr7抑制后是否会增加基因组的突变需要进一步研究。无论用单链DNA还是用质粒DNA做基因敲入，都需要在供体上CRISPR/Cas9识别的位置加上几个同义的碱基突变，以免敲入成功后又被CRISPR/Cas9破坏了。
除了上述两种常用的基因敲入方法，还有其他几种方法值得借鉴。有研究发现，通过NHEJ方法可以有效地将外源基因定点整合到基因组。利用NHEJ途径插入外源基因时，需要在供体质粒上引入编辑位点，基因组和供体质粒同时被切断，供体质粒DNA会被连接到基因组上，但是这种连接有正反两个方向。细胞中除了经常提及的NHEJ和HR修复途径，还有一个微同源性末端连接（MMEJ）修复途径，它依靠5～25 bp的同源序列将DNA两端融合在一起。有研究者在供体质粒上设计了两个20 bp的同源臂，基因编辑技术同时切断基因组DNA质粒和供体质粒，供体质粒会通过MMEJ定向整合到基因组。但是这两种方法的效率都不高，最近有两个课题组发现，把同源臂增加到600～800 bp可以显著提高敲入效率。随着研究的深入，更多的新方法会被发明出来。
4.CRISPR/Cas9导入细胞
CRISPR/Cas9可以对体外培养的细胞系或者原代细胞进行编辑，也可以对受精卵和体内细胞进行编辑。编辑不同的对象需要采取不同的方法将CRISPR/Cas9导入到细胞中。编辑体外培养细胞时，有很多种方法可以将CRISPR/Cas9质粒导入到细胞中，常用的方法是Lipofactamine、PEI和电转。Lipofactamine和PEI简单廉价，是首选方法；电转成本比较高，但是效率高。这几种方法都是瞬时转染，细胞培养1周后质粒就会丢失。某些类型的细胞只有用病毒的方法才能转进去，常用的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）。其中逆转录病毒和慢病毒会整合到基因组，可以长期表达转基因，优点是可以提高编辑效率，缺点是整合过程中可能会导致额外的基因突变，长期表达CRISPR/Cas9也会增加脱靶的效率。AAV主要以非整合形式表达转基因，但是会有少量整合的情况发生。AAV载体在机体中产生的免疫排斥小，是基因治疗的理想载体。有研究发现，一个较小的Cas9蛋白可以包装在AAV病毒中，这给基于CRISPR/Cas9的基因治疗带来了希望。腺病毒不会整合到基因组，对某些类型的细胞转染效率较高。上述几种方法都有各自的优缺点，需要研究人员根据实验需要选择合适的方法。
建立单克隆细胞系一般都采用瞬时表达sgRNA和Cas9的方法，质粒导入到细胞中2～4 d后，将细胞稀释成单细胞重新种到培养皿中培养，形成克隆后鉴定编辑是否发生。有的细胞不能形成克隆，需要将单细胞种到96孔板中培养。有些细胞转染效率低，需要在质粒上同时表达GFP，通过流式细胞仪分选出转染成功的细胞会提高编辑效率。最常用的CRISPR/Cas9质粒如PX458（同时表达GFP）、PX459（同时表达puromycin抗性基因）等，均可从Addgene公司购买。
利用CRISPR/Cas9敲除基因时，瞬时表达的方法编辑时间短，编辑效率一般为3%～30%；利用病毒的方法可以长期提高编辑效率，但是病毒整合到基因组上就无法去除了。理想的方法是编辑时间可控，编辑后细胞不再含有CRISPR/Cas9等外源基因。附着体载体不整合到基因组，但可以随着细胞的复制而复制，就像普通质粒可以在细菌中复制一样。在嘌呤霉素的筛选作用下附着体载体一直保留在细胞中，外源基因长期稳定地表达，可以长期编辑细胞。嘌呤霉素筛选还可以富集转染成功的细胞，即使转染效率很低的细胞也能够实现高效的编辑；编辑完成后，去除筛选药物，附着体载体会在1周内迅速丢失，细胞中不再表达外源基因。附着体CRISPR的编辑效率一般在80%以上，附着体CRISPR还可以实现高效的多基因敲除和基因组片段敲除。
如果编辑的目的是制作动物模型，则需要对动物的受精卵进行编辑。受精卵中储备了大量的mRNA，很少有新的基因转录发生，因此不能使用DNA质粒表达Cas9和sgRNA，需要将sgRNA和Cas9在体外转录成mRNA，通过显微注射的方法导入细胞中。制作基因编辑的小鼠和斑马鱼请参考Jaenisch和Burgess实验室的方法。
5.提高CRISPR/Cas9的特异性
提高CRISPR/Cas9特异性的方法除了选择特异的sgRNA序列外，还有其他方法。5′末端截短的sgRNA（Tru-sgRNA）也可以提高Cas9的特异性。Tru-sgRNA一般只有17或18 bp和靶向序列互补配对，短的sgRNA可能无法和错配的DNA序列结合，因而能够提高特异性。在sgRNA的5′端额外加入两个G，即5′GG+sgRNA（20 bp），也可以提高靶向特异性，但这两种方法有时候会严重降低靶向切割效率。
双切口（double-nicking）技术是最早报道的提高特异性的方法。Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域，分别是RuvC和HNH，每个结构域分别负责切断一条DNA单链，一个结构域突变后不影响另外一个结构域的切割功能，在RuvC结构域引入D10A突变后，Cas9只能切断单链（single-strand break，SSB）DNA。如果在DNA上设计两个sgRNA，引导Cas9分别切断两条单链DNA，就会形成双链断裂，因为识别的DNA序列变长了，所以特异性就提高了。单个sgRNA脱靶后只能切割产生单链DNA断裂，被修复后一般不会产生突变。有两个课题组将RuvC、HNH突变后，Cas9完全失去了切割功能，但是保留了靶向结合DNA的功能，被称为dCas9（dead Cas9）。将dCas9和Fok I融合为核酸酶，类似于前面介绍的ZFN和TALEN，单个dCas9-FokI脱靶后不会切割DNA，从而进一步提高了特异性。但是这两种方法都有其局限性，它们需要两个sgRNA活性都高才能有效地发挥功能，且后者对两个sgRNA距离有严格的条件要求，FokI酶才能形成二聚体发挥作用，这样的位点在基因组中非常少，因此这些方法没有得到广泛应用。
2015年，张锋和Keith实验室通过对SpCas9蛋白的改造提高特异性，两个实验室采用了不同的策略，但都达到了提高特异性的目的。SpCas9与DNA结合时，它上面的正电荷氨基酸形成一个凹槽，与负电荷的DNA结合，这种结合是非特异性的。张锋实验室在凹槽区域用中性电荷氨基酸来代替正电荷的氨基酸，得到的SpCas9叫作eSpCas9，它与DNA非特异性的结合力减弱，脱靶效应被降低。与此同时，Keith实验室采取另外一种原理降低脱靶效应。当SpCas9核酸酶与DNA结合时，SpCas9上的一些氨基酸会和DNA的磷酸骨架之间形成氢键，增加SpCas9和DNA之间的非特异性结合力。如果将形成氢键的氨基酸替换为不能形成氢键的氨基酸，得到的SpCas9称为SpCas9-HF1，它与DNA非特异性的结合力减弱，从而降低脱靶效应。这两种方法虽然降低了脱靶效应，但是有时也会降低靶向切割的效率。高特异性Cas9可能会在临床应用方面发挥重要作用，关于各种提高特异性方法的总结见表4-3。
表4-3 提高CRISPR/Cas9特异性的方法
