一、重组子的筛选
重组子筛选主要是通过表型的改变或者采用琼脂糖对重组子相对分子质量的鉴定来筛选。常见的筛选方法有以下几种。
1.抗药性筛选法
抗药性筛选法也称为插入失活法，有一些质粒载体带有两个或两个以上的抗生素抗性基因，由此可以把其中一个抗性标记作为转化子的选择标记，另一个作为重组子的筛选标记。当外源DNA插入质粒中一个抗性基因序列内部时，由于基因编码序列受到破坏，相应的抗生素抗性消失，这一现象即为插入失活，而非重组的质粒还具有这种抗性，这样就可以把重组子区分出来。
例如，pBR322质粒（图10-8），当外源基因插入BamH I位点后，破坏了Tet抗性基因的编码序列，导致质粒失去Tet的抗性。当把转化产物涂布到含有Amp的LB平板培养基上，就可以把含有质粒的转化子筛选出来。在含有Amp的LB平板培养基长出来的菌落一部分是含有重组质粒的，一部分是含有自身环化的质粒。再把这些菌落按相同顺序分别点样接种在含有Amp和Tet的平板培养基上。在Amp培养基上生长但在Tet培养基上不能生长的单抗性菌落是含有重组质粒的，在两种抗生素培养基上都能生长的双抗性菌落是不含有重组质粒的。
图10-8 pBR322质粒的结构图
2.插入表达筛选法
插入表达筛选法是指外源基因片段插入载体后，基因得到表达，使菌落出现表型的改变，进而把重组子区分出来。此法常用于构建的表达载体的筛选。例如在构建的淀粉酶基因表达载体的筛选中，可以在Amp的LB平板培养基上添加淀粉和锥虫蓝，淀粉能和锥虫蓝发生反应，产生蓝色的物质，使平板呈蓝色。如果载体上插入淀粉酶基因，表达后产生的淀粉酶会降解培养基中的淀粉，使得菌落位置产生水解透明圈；反之蓝色菌落所含有的载体没有插入淀粉酶基因。
3.形成噬菌斑筛选法
对于以λ噬菌体为基础的载体，当外源DNA片段插入载体后形成重组λDNA，只有其分子大小为野生型λDNA的78%～105%时，才能在体外包装成具有成熟感染能力的噬菌体颗粒。转化受体菌后，转化子能在平板上裂解形成噬菌斑，而非转化子能正常生长形成菌落，两者有明显的差别，很容易区分。
4.琼脂糖电泳筛选法
提取质粒DNA进行琼脂糖电泳，可观察质粒相对分子质量的大小。由于插入外源片段的质粒相对分子质量变大，通过对照比较可区分出插入外源片段的重组子，也可以进一步通过酶切，或者利用PCR扩增插入片段，再进行电泳分析以确定阳性克隆子。提取质粒DNA进行琼脂糖电泳分析的鉴定成本高，工作量也大，筛选效率低。为了提高电泳的筛选效率，可以将菌体裂解后直接电泳分析。
菌体裂解电泳分析的原理是：利用碱裂解法对菌体进行裂解，然后将裂解的混合物进行电泳，通过对照比较质粒的相对分子质量大小来确定重组质粒。此法无须提取质粒DNA，可以大大提高筛选的效率。
菌体裂解电泳分析的步骤是：在血清板微孔中依次添加溶液Ⅰ5μL、培养过夜的菌液20μL、溶液Ⅱ10μL，并用吸头吸打一次以混匀溶液，静置片刻再加入10×琼脂糖电泳上样缓冲液3μL，然后上样；把上样的凝胶小心放入电泳槽，小心加入电泳液，使其刚好没过胶面，电泳后观察。需要注意的是，加完溶液Ⅱ后，裂解菌体的溶液比较黏稠，加样较困难，所以先加样再加缓冲液。此外在溶液Ⅰ中，RNase可以减少RNA对观察电泳结果的影响。
菌液裂解电泳法，具有快速、简单等优点，但是需要重组质粒和空白质粒的相对分子质量有一定的差异，才能达到很好的鉴别效果，但也还需要进行进一步的质粒提取并酶切电泳分析验证。
5.菌落或菌体PCR筛选法
菌落或菌体PCR筛选法的原理是：菌落或微量菌体在高温下会裂解释放出质粒，以质粒作为PCR的模板，根据插入片段序列设计引物来进行目的片段的扩增，然后用电泳分析PCR产物，若有目的条带出现，则可初步判断为重组子。
菌落或菌体PCR筛选法是取平板上的菌落或微量培养孔上的少量菌体加到PCR反应体系中，并做好对应序号的标记，然后进行PCR反应和电泳分析。该方法快速、简单，但成本较高，容易产生假阳性，初步筛选判断为重组子的菌落需要进一步扩大培养以提取质粒进行酶切验证。