二、核酸内切酶
核酸内切酶是一类可水解分子链内部磷酸二酯键，生成寡核苷酸的核酸酶，与核酸外切酶相对应。
1.S1核酸酶
S1核酸酶来源于米曲霉，是一种高度单链特异的核酸内切酶，在最适反应条件下，以内切方式降解单链DNA或RNA，产生带5′磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。S1核酸酶降解单链DNA的速率要比降解双链DNA速率快75 000倍，对dsDNA、dsRNA和DNA-RNA杂交体不敏感，这种酶的活性表现需要低水平的Zn2+存在，最适pH值为4.0～4.3。如果所用酶量过大，则双链核酸可以被完全消化，而中等量酶可在切口或小缺口处切割双链DNA。
S1核酸酶的单链水解功能可以作用于双链核酸分子的单链区，并从单链部位切断核酸分子，而且这种单链区可以小到只有一个碱基对。所以S1核酸酶在DNA分子操作实验中可以应用于分析核酸杂交分子（RNA-DNA）的结构、给RNA分子定位、测定真核基因中间隔子序列的位置、去除DNA片段中突出的单链尾，以及打开在双链cDNA合成期间形成的发夹环等。
2.绿豆核酸酶
绿豆核酸酶来源于绿豆芽，是一种内切方式的单链特异性核酸内切酶，可将单链DNA降解为具有5′-磷酸末端的单核苷酸或寡核苷酸，如果使用过量（1 000倍），也可以将寡聚体完全降解为单核苷酸。与S1核酸酶不同，绿豆核酸酶不能切断切口对侧的链，过量的酶还可以降解双链DNA、RNA或者DNA-RNA杂交体，这时，它会选择性地降解富含AT的区域，易在A↓pN、T↓pN的位置降解，尤其在A↓pN位置上能100%降解，不易在C↓pC、C↓pG的位置降解。
酶学特性与S1核酸酶相似，酶活力比S1核酸酶温和，在大切口上才能进行切割。绿豆核酸酶可使DNA突出端切成平端，但绿豆核酸酶在末端为GC时容易出现碱基残留，而S1核酸酶容易发生切入现象。
3.BAL 31核酸酶
BAL 31核酸酶来源于Alteromonas espejiana，是一种以内切方式特异性地降解单链DNA的核酸酶。BAL 31核酸酶活性依赖Ca2+，EDTA可抑制其活性，对双链DNA中瞬时单链区也有降解作用，能切断单链缺口的双链DNA。
与S1核酸酶和绿豆核酸酶不同，BAL 31核酸酶同时具有双链特异的核酸外切酶活性，在没有单链时也作用于双链DNA，表现出从DNA两端同时降解的5′→3′及3′→5′的外切酶活性，但3′→5′的外切酶活性高于5′→3′，所以在反应产物中平末端的DNA分子只有10%左右，而5′突出的（约5bp）的DNA分子约为90%。如果要进行平端连接，需要用T4 DNA聚合酶进行补平。
BAL 31核酸酶和核酸外切酶Ⅲ的外切酶活性都可以进行DNA片段的双向缺失，不同的是核酸外切酶Ⅲ可以对DNA片段进行单向缺失。BAL 31核酸酶外切酶活性碱基的依存性较高，富含GC的位置上不易降解，而核酸外切酶Ⅲ的碱基特异性较小，更适合用于DNA的缺失制作。BAL 31核酸酶主要适用于以切除220～1 000 bp为目的的反应，而核酸外切酶Ⅲ则适用于切除100 bp以下的碱基。由于使用BAL 31时的碱基依存性较强，因此，对于反应不容易进行的DNA，使用受碱基影响较小的核酸外切酶Ⅲ长时间分解为好，两种酶生成的DNA片段平末端的效率大约都为10%。
4.脱氧核糖核酸酶Ⅰ
脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DeoxyribonucleaseⅠ，DNaseⅠ），是一种可以消化单链或双链DNA，产生单脱氧核苷酸、单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNaseⅠ水解单链或双链DNA后的产物，5′端为磷酸基团，3′端为—OH。
目前用于DNA分子操作实验中的商品化的DNaseⅠ是从牛胰腺纯化得到的，其活性依赖Ca2+，并能被Mg2+或Mn2+激活。在Mg2+存在的条件下，DNaseⅠ可随机剪切双链DNA的任意位点，形成切口；在Mn2+存在条件下，DNaseⅠ可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1～2个核苷酸突出的黏末端的DNA片段。此外还有一种商品化重组脱氧核糖核酸酶Ⅰ（recombinant DNaseⅠ），或者DNaseⅠ（DNase-free）酶，几乎完全除去了RNase和蛋白酶，从而提高了酶在pH中性区域的稳定性，可以安全地用于RNA的制取。
DNaseⅠ的主要用途有：缺口平移法标记探针前用DNaseⅠ处理DNA，使之形成若干缺口；建立随机克隆，进行DNA序列分析；分析蛋白-DNA复合物（DNA酶足迹法）；除去RNA样品中的DNA（RNase-free）等。
5.核糖核酸酶
核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）是一种从分子内部转移性水解RNA的核酸酶，可分为内切核糖核酸酶（endoribonuclease）和外切核糖核酸酶（exoribonuclease）。DNA分子操作实验中最常用的有核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）和核糖核酸酶H（ribonuclease H，RNase H）。
RNase A是一种来源于牛胰的具有高度专一性的核酸内切酶，可特异性攻击RNA上嘧啶核苷酸的C3上的磷酸根和相邻核苷酸的C5之间的键，形成带3′嘧啶单核苷酸或以3′嘧啶核苷酸结尾的低聚核苷酸产物。还有一种来自米曲霉的商品化的核糖核酸酶T1（RNase T1），其功能和用途与RNase A相似。
RNase A的主要用途有：除去DNA样品中的RNA；除去DNA-RNA中未杂交的RNA区；确定杂交体DNA中RNA的单突变的位置。
RNase H现已知广泛存在于哺乳动物细胞、酵母、原核生物及病毒颗粒中，所有类型细胞均含有不止一种RNase H。目前商品化的RNase H是从小牛胸腺中发现而被分离出来的，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA上的磷酸二酯键，产生3′-OH和5′-磷酸末端的产物。RNase H不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。
RNase H的主要用途有：合成cDNA第二链之前去除RNA；用DNA指导在特异位点切割RNA等。