基因工程克隆载体的发展概况
人们通过对天然质粒、病毒的改造成功构建了多种克隆载体，例如，1977年Boliver等学者从天然质粒出发，经删除、融合、转座及重排等操作，成功构建了适合多种用途、至今仍广泛使用的克隆载体pBR322。自Cohen等1973年构建第一个质粒载体pSC101作克隆载体以来，越来越多的克隆载体相继出现，这些载体的发展推动了结构基因组学和功能基因组学研究的发展，同时随着人类基因组计划和植物基因组计划的实施，克隆载体的整体结构、克隆能力和转化效率等都有了长足的发展。克隆载体的发展可以划分为三个阶段：
①第一阶段以质粒、λ噬菌体、柯斯质粒（又称黏粒）为主，这些载体的主要特点是在宿主细胞内稳定遗传、易分离、转化效率高，但是克隆外源DNA片段大小有限，质粒一般小于10 kb，柯斯质粒能克隆较大的片段，一般小于45 kb。
②第二阶段克隆载体则突破了上述载体容量，其显著特点是克隆载体容纳外源DNA片段的能力大大提高，可以容纳100～350 kb以上，这种类型的载体主要有YAC、BAC、PAC以及人类人工染色体（human artificial chromosome，HAC）。
YAC含有酵母染色体端粒（telesome，TEL）、着丝点（centromere，CEN）及复制起点等功能序列，可插入长度达200 kb～2 Mbp的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖。YAC成为人基因组研究计划的重要克隆载体，其优点是可以容纳较大的外源DNA片段，这样用较少的克隆数，可以包含特定基因组的全部序列，从而保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理图谱的制作。但YAC还存在一些不足：嵌合发生率高，易使基因组本不连续的片段连接在一起形成嵌合体，给后面的序列组装带来困难；具有不稳定的特点，在转代培养中可能会发生DNA片段的缺失或重排，很难与酵母染色体分离等缺点，极大地制约了以YAC为基础的大基因和大基因簇的转基因研究。
BAC是一种以F质粒（F-plasmid）为基础构建而成的细菌染色体克隆载体，主要包括oriS，repE（控制F质粒复制）和parA、parB（控制拷贝数）等成分。BAC载体形成嵌合体的频率较低，以大肠杆菌为宿主，可以通过电穿孔导入细菌细胞，转化效率高，而且以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化，常用来克隆150 kb左右的DNA片段，最多可保存300 kb。BAC拷贝数低，稳定，比YAC易分离，常规方法（碱裂解）即可分离BAC，蓝白斑、抗生素、菌落原位杂交等均可用于目的基因筛选，对克隆在BAC上的DNA可直接测序。
PAC是基于P1噬菌体构建的克隆载体，是一种与黏粒载体工作原理比较相似的高通量载体，它含有很多P1噬菌体来源的顺式作用元件，将BAC和P1噬菌体载体二者优点结合起来，可以容纳70～100 kb大小的外源DNA片段。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到P1噬菌体颗粒中，后者总容量可达115 kb（包括载体和插入片段）。将载体导入到表达Cre重组酶的大肠杆菌细胞中，线状DNA分子通过重组于载体的两个loxp位点之间而发生环化。载体还携带一个通用的Kan选择性标记，一个区分携带外源DNA克隆的阳性标记sacB以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的P1质粒复制子。另外一个P1复制子（P1裂解性复制子）在可诱导的tac启动子控制下，用于DNA分离前质粒的扩增。
HAC是一种转染人体肿瘤细胞株后，在细胞内组成的线状微型染色体，包含构成人工染色体的所有基本结构，即端粒、复制起点及着丝点。HAC可作为载体搭载一些基因，并可作为人类细胞中额外的染色体（第47个），使这些基因表达于人体内。HAC可容纳600～1 000 Mbp的大片段基因组DNA，可应用于转基因动物模型和基因治疗等方面。
③第三阶段是双元大片段克隆载体的构建。
YAC和BAC等载体都不能直接进行植物转化，在候选克隆的转化互补实验中需要将外源片段进行亚克隆，因而工作量大，同时也有漏失目的DNA片段的可能。因此，可直接用于植物转化的大片段双元载体便应运而生，其中，双元细菌人工染色体（BIBAC）和可转化人工染色体（TAC）最具有代表性。
双元细菌人工染色体在结构上具有BAC的复制系统，又具有能在根癌农杆菌中起作用的R复制子和抗卡那霉素筛选标记及T-DNA的左右边界，因此BIBAC能在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭复制。双元表达载体系统主要包括两个部分，一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T-DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T-DNA的转移。另一部分是微型Ti质粒，它在T-DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如NPTⅡ基因以及Lac Z基因等。
可转化人工染色体载体具有P1复制子和Ri质粒pRiA4复制子，能在大肠杆菌和农杆菌中穿梭复制，还带有植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因和能被植物识别的启动子等元件。
TAC载体与BIBAC载体一样具有克隆大片段DNA和借助于农杆菌直接转化植物的功能，除具有BAC载体的优点外，同时还具有大肠杆菌和农杆菌的复制子，是一个穿梭质粒，能在大肠杆菌和农杆菌中均保持稳定，可通过农杆菌介导直接进行基因功能互补实验。