提高PCR反应的特异性的策略
1.热启动PCR
热启动PCR的原理是：通过抑制一种基本成分来延迟DNA合成开始，直到PCR仪达到变性温度。尽管Tag DNA聚合酶的最佳延伸温度在72～74℃，但其在室温仍然具有活性，因此，在进行PCR反应配置过程中，以及在热循环刚开始，温度低于退火温度时仍然会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增，所以减少热循环开始前的DNA合成反应就可以大大减少非特异性的扩增。热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。热启动PCR的方法可以分为手动和自动两种。
手动热启动PCR是通过延缓加入一种PCR基本组分来避免DNA合成反应在未达到变性温度前就开始，如在完成预变性后再加入Taq DNA聚合酶，使PCR开始。手动热启动PCR的缺点是十分烦琐，无法实现高通量的应用，此外在高温时打开PCR管的盖子容易造成水分蒸发，使PCR体系发生变化。对于热启动要求不高的常用方法是在冰上配制PCR反应液，然后再放到预热的PCR仪上进行反应，这种方法简单、成本低，但并不能完全抑制DNA聚合酶的活性，因此不能完全消除非特异性产物的扩增。
自动热启动PCR是通过抑制DNA合成在达到变性温度之前开始来实现的。早期的热启动是使用蜡防护层将一种基本成分（如镁离子或酶）包裹起来，或者将反应成分（如模板和缓冲液）物理地隔离开。在热循环达到变性温度时，蜡熔化，各种成分释放出来并混合在一起。与手动热启动方法一样，蜡防护层法的制作比较烦琐，容易被污染，也不适用于高通量应用。
目前的热启动PCR是基于DNA聚合酶的自动热启动PCR，它的原理是使DNA聚合酶在高温下才被活化，避免在未达到设定温度前就开始反应。这类酶主要包括化学修饰的Taq DNA聚合酶、抗体结合的DNA聚合酶和PCR抑制剂结合的Tag DNA聚合酶。
化学修饰的Taq DNA聚合酶，也称Hotstart Tag，在常温下，它的活性被化学基团封闭，要在94～95℃加热数分钟（10～15 min）才能恢复正常活力开始反应。这种酶的特点是：价格较便宜，但它需要94～95℃加热数分钟才能恢复活力，会在一定程度上缩短酶的半衰期，抑制酶的扩增效率。
抗体结合的Taq DNA聚合酶，商品名为Platinum Taq，它是一种复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在94～95℃下加热数分钟（2～5 min）才能够恢复酶活性。其特点是：与经化学修饰的Taq DNA聚合酶相比，Platinum Taq保真度较高，不需要在94℃延时保温（10～15 min）以激活聚合酶，扩增效率较高。
PCR抑制剂结合的Taq DNA聚合酶，商品名为HotMasterTM Taq DNA聚合酶，它利用一种温度依赖性方式来可逆地阻断酶的活性。HotMasterTM Taq DNA聚合酶在温度低于40℃时，以非活性的酶—抑制剂复合物的形式存在，在高温条件下抑制剂与酶分离，聚合酶的活性立即恢复，抑制剂是热稳定的，当温度再降低时又能重新形成非活性的酶—抑制剂复合物，所以这种抑制过程随着PCR的热循环是可逆的。与一般热启动Taq DNA聚合酶的不同之处在于，一般的热启动Tag DNA聚合酶只在第一步温度升高之前封闭酶的活性，而HotlasterTM Taq DNA聚合酶不但能在反应的起始阶段提供热启动控制，而且可以使每个PCR循环过程在退火时达到冷终止的效果。其特点是：热启动更严格，最大程度减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物的非特异性合成，但酶的价格相对较贵。
2.巢式PCR
巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应，使用两对或者三对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR相似。第二对引物（称为巢式引物）结合在第一次PCR产物内部（也因此称为内引物），使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此，巢式PCR扩增的目标序列特异性非常高。
巢式PCR需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增15～30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。巢式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。
若将PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（25～30 bp），同时缩短内引物长度（15～17 bp），使外引物先在高退火温度下复性，做双温扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入。
3.降落PCR
降落PCR的原理是随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带。
降落PCR选择初始复性温度的原则是起始复性温度应该比引物的T m 高出5～10℃，以后每次循环递减1～2℃，在T m 扩增10～25次循环。