制备片段的连接策略
制备片段是指经过内切酶或者其他工具酶处理的目的DNA片段。最简单的连接策略是将插入片段补平后再与用平端酶（如SmaⅠ）处理过的载体进行平端连接，但这种方式的效率较低，尽量少用，尽可能使用黏性末端连接方式。根据片段特性和连接要求不同，制备片段的连接可以采用以下几种策略。
1.相同内切酶或同尾酶末端的连接
采用相同的内切酶或同尾酶分别处理插入片段，得到相同黏性末端进行连接。采用相同内切酶产生的末端连接后，由于其识别位点没有改变，所以插入的片段能被相同的内切酶切下。两个同尾酶产生的末端连接后，反向重复序列的识别位点消失，所以不能被原来的两种酶识别，如图10-3中的BglⅡ和BamHⅠ产生的黏性末端，连接后在识别处产生两种新的序列，都不能被BglⅡ或BamHⅠ识别。
图10-3 BglⅡ和BamH I产生的末端连接后识别位点消失
2.不同内切酶末端部分补平的连接
如果不同内切酶的黏性末端是不相同的，则不能采用黏性末端的连接方式，但是如果两个不同内切酶的黏性末端具有部分相同碱基，则可以部分补平后再进行黏性末端连接。这种连接方式在连接位点处插入了两个碱基，产生的新的序列也不能被原来的两种酶识别（图10-4）。
图10-4 HindⅢ和XbaⅠ产生的末端部分补平后连接
3.同聚物加尾连接
同聚物加尾连接法也称多聚核苷酸投影法，这个方法的基本原理是利用末端转移酶在载体和插入片段制造出互补的黏性末端，而后进行黏性末端连接。如在载体的末端添加一段poly（G），在插入片段末端添加一段互补poly（C），这样载体和插入片段就可以通过碱基互补进行黏性连接（图10-5）。同聚物加尾连接法是一种人工提高连接效率的方法，属于黏性末端连接的一种特殊形式，与黏性末端连接效果一样，但是其操作步骤较多，多用于基因文库的构建。
图10-5 同聚物加尾连接方式
4.人工接头连接法
人工接头（linker）连接法是在待连接的DNA片段的平末端先连接上一段带有内切酶识别位点的接头或适当分子，然后再用内切酶进行酶切反应，即可使待连接的片段产生黏性末端。该方法首先是合成带有酶切位点和保护碱基的寡聚核苷酸引物，如果设计成互补的反向重复序列，就只需要合成一条引物，如果不是就需要合成两条引物；然后用T4多聚核苷酸激酶对引物进行磷酸化处理，使5′端带上磷酸基团，再进行变性、复性即可得到双链的人工接头。双链人工接头和待连接的片段进行连接，然后用内切酶处理就可以使待连接的片段产生黏性末端（图10-6）。
当复性形成双链的接头时，由于合成引物的5′端是去磷酸化的，没有磷酸基团，无法进行连接，所以合成的引物需要进行磷酸化处理后再复性，或者复性后再进行磷酸化，使接头的5′端带上磷酸基团，再与待连接的片段进行连接。
人工接头连接法可以有效减少载体的自连，提高重组率；重组子插入片段可进行酶切回收，也可以由一个酶切位点换成另一个酶切位点。不过该方法需要合成专门的接头，且待连接片段序列中不能与接头的酶切位点一致，如果待连接片段是未知的序列，就会存在被破坏的可能。为了解决这一不足，可以在人工接头引入多个酶切识别位点，这样更方便后续的内切酶选择。
5.DNA衔接物连接法
DNA衔接物连接法是采用一种人工合成的有黏性末端的特殊双链寡核苷酸短片段和待连接的片段连接，使待连接的片段产生黏性末端。与人工接头不同的是，衔接物的一个末端是某种限制酶的黏性末端，用于与载体连接，另一末端是平末端，用于与待连接的片段相连。
图10-6 EcoRⅠ人工接头形成黏性末端的步骤
衔接物连接法在操作上和人工接头连接法相似，但是衔接物和待连接片段连接后就可以直接产生黏性末端，不需要进行内切酶的消化，从而避免了未知序列的连接片段因存在内切酶的识别位点而被切断的可能。但是该方法在操作上较人工接头连接法复杂，需要进行两次磷酸化处理。
衔接物连接法是设计合成一长一短两条能互补形成黏性末端的寡聚核苷酸引物，为了防止衔接物自身连接成二聚体，提高其和外源片段的连接效率，在制备衔接物的时候需要经过两次磷酸化：第一次是将短引物进行磷酸化处理，使衔接物只有平末端的5′端具有磷酸基团，而黏性末端的5′端没有磷酸基团，避免衔接物自身连接形成二聚体，但可以和待连接片段进行平末端连接；第二次磷酸化在衔接物与外源片段连接之后，目的是使待连接片段变成5′端具有磷酸基团的黏性末端（图10-7），以和具有相同黏性末端的载体进行连接。
图10-7 EcoRⅠ衔接物和插入片段的连接步骤