八、生物安全
登革热实验室检测应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求，做好生物安全工作。
附件：
13.血液标本采集、血清分离、运送、保存标准化操作程序。
14.酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序。
15.胶体金免疫层析法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序。
16.RT-PCR法分型检测登革病毒核酸标准操作程序。
17.细胞培养分离登革病毒。
18.IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体。
19.酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序。
20.免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序。
21.伊蚊标本采集与处理操作程序。
22.疑似登革热病人检材送检一览表。
23.病原学检测结果一览表。
附件13 血液标本采集、血清分离、运送、保存标准化操作程序
1 目的
正确采集血液标本、分离血清、运送和保存。
2 范围
适用于有资质的人采集登革热患者或疑似患者血液标本、分离血清、编号、分装、保存和运送。
3 操作步骤
3.1 采血
3.1.1 用70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30s以上。
3.1.2 用一根碘酊或碘伏棉签消毒皮肤（1%～2%碘酊30s或10%碘伏消毒60s），从穿刺点向外以1.5～2cm直径画圈进行消毒。
3.1.3 用70%酒精脱碘。
3.1.4 严格执行三步消毒后（注意对碘过敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒60s），待穿刺部位酒精挥发干燥用无菌真空管采集患者非抗凝血5mL。
3.2 分离血清
3.2.1 轻缓颠倒采血管数次，使血液与促凝剂混匀后静置，待血块完全凝固（放置时间过长会造成溶血，避免留置过夜）。
3.2.2 3000rpm离心，5min，然后用无菌吸管小心取上清转入3支冻存管，应避免吸取血细胞。
3.2.3 用标签纸或持久性标记笔在冻存管的侧壁标记标本编号，顶端标记序列号，标记清楚后将血清放进标本盒，保存于2～8℃冰箱待初筛检测或运送保存。在编码规则为“地区拼音首字母（JH）年份（2位）月（2位）-序列号（3位）”，如景洪市2013年8月份采集的第12份血标本的血清编号为JH1308-012，冻存管顶端分别标记012-1，012-2和012-3。
3.3 运送保存
3.3.1 如果24小时能够完成初筛检测，并将标本运送至上级单位，运送前应将标本保存于2～8℃冰箱，运送时采用低温冷藏运输。
3.3.2 如果不能及时运送，运送前应将标本保存于-20℃冰箱，运送时采用干冰或低温冷藏运输。
3.3.3 样本长期保存应记录剩余血清量和盒中位置，保存于-70℃以下冰箱。
3.3.4 所有样本运输和保存应遵守国家相关生物安全规定。
4 注意事项
4.1 使用后的注射器和针头应放置于耐扎的容器中，最后集中高压消毒，在任何情况下均不应试图将针头重新盖帽。
4.2 采血结束后脱掉手套并弃于耐高压的废弃袋中，以备集中高压灭菌，并立即用肥皂和水洗手。
4.3 若发生针刺、皮肤破损或其他损伤，应立即用肥皂和水清洗伤口，不要立即止血。
4.4 当血液污染了身体的任何地方或发生针刺等事故时，均应及时报告上级并按医疗救护规程进行评估和救护。
附件14 酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序
1 目的
酶联免疫法检测患者血清中登革病毒NS1抗原。
2 适用范围
适用于患者血清或血浆中登革热病毒NS1抗原的快速检测。
3 实验前准备
3.1 核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2 检测前应将待测样品置于2～8℃冰箱或冰上。
4 检测项目及参数
本方法检测项目为检测血清或血浆中登革热病毒抗原。
5 检测仪器设备和材料
加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）。
6 检测的环境条件
生物安全二级实验室（BSL-2）中进行，灭活后样本在生物安全一级实验室（BSL-1）内进行。
7 操作步骤
7.1 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30min，使用前将试剂轻轻震荡混匀。
7.2 配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释。
7.3 编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔。
7.4 加稀释液：每孔加稀释液50μL，空白孔除外。
7.5 加样：分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各50μL，空白孔除外。
7.6 温育：用封板膜封板后，置37℃温育60min。
7.7 每孔加酶标试剂50μL，空白孔除外，轻轻震荡混匀。
7.8 温育：用封板膜封板后，置37℃温育30min。
7.9 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量控干。
7.1 0 显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。
7.1 1 测定：每孔加终止液50μL，10min内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处［建议使用双波长450nm/（600～650）nm检测］，用空白孔调零后测定各孔A值。
8 结果判定
8.1 临界值计算：临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。
8.2 阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A≤0.1（若1孔A大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照大于0.1，应重复实验）。
8.3 阳性对照正常值范围：A≥0.8.
8.4 阳性判定：样品A值≥临界值者为登革病毒抗原阳性。
8.5 阴性判定：样品A值＜临界值者为登革病毒抗原阴性。
9 意义
结合临床信息，阳性结果可以诊断为登革病毒感染，但阴性结果并不排除登革病毒感染的可能。
附件15 胶体金免疫层析法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序
1 目的
检测患者血液中登革病毒抗原。
2 适用范围
检测患者血清、血浆、全血中登革病毒抗原水平，主要用于登革病毒感染的辅助诊断。
3 实验前准备
3.1 核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2 检测前应将待测样品置于2～8℃冰箱或冰上。
4 检测项目及参数
本方法检测项目为检测血清或血浆中登革病毒抗原。
5 检测仪器设备和材料
加样器、登革病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）。
6 检测的环境条件
生物安全二级实验室（BSL-2）中进行，灭活后样本在生物安全一级实验室（BSL-1）内进行。
7 检测步骤
7.1 将试剂盒和待检样本自冰箱中取出平衡至室温。
7.2 当准备好测试时，打开密封的铝箔袋，取出检测卡，平放于水平桌面上。
7.3 在检测卡上标记病人的样本号。
7.4 加样：用滴管从样本中取1滴（30～45μL）血清或血浆标本，加于检测卡/条上的加样区内，另外加1滴（30～45μL）稀释液，保证操作过程中没有气泡产生。（如果加样后30s，没有看到样本移动，可能是由于样本太黏稠，可在样本加样孔内再加1滴样本稀释液）
7.5 加入样本后20～25min内判读结果，并将结果拍照。
8 结果解释
8.1 阴性结果：仅质控线C出现肉眼可见条带。
8.2 阳性结果：质控线C和检测线T均出现肉眼可见条带。
8.3 无效结果：未肉眼可见的质控线C。
8.4 质量控制：如遇下列情况，请按上述操作步骤使用实验室备用的阳性和阴性样本对该批产品进行质量控制：
8.4.1 新检验员使用本产品。
8.4.2 使用新批号产品。
8.4.3 试剂卡储存温度在2～30℃以外。
8.4.4 测试区温度在2～30℃以外。
9 意义
阳性结果说明检测到登革病毒抗原，结合临床可以诊断为登革病毒感染；阴性结果说明没有检测到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。
附件16 RT-PCR法分型检测登革病毒核酸标准操作程序
1 目的
登革热患者和/或媒介伊蚊标本中病毒核酸的提取及PCR分型检测。
2 适用范围
适用于患者血标本及其传播媒介标本的检测。
3 检测的环境条件
在标本中提取登革病毒RNA的实验要求在BSL-2实验室操作，PCR分型检测在专门PCR室或区域操作。
4 实验步骤
4.1 实验准备
4.1.1 在标本中提取登革病毒RNA要求在BSL-2实验室，PCR分型在综合实验室独立区域或专门PCR室操作。
4.1.2 进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂、样品。预约实验场所，并看前一位实验者是否已经清场。
4.2 RNA的提取
4.2.1 使用QIAampViral RNAMini试剂盒提取血清标本中病毒RNA。
4.2.1.1 吸取560μL包含载体RNA的AVL缓冲液至1.5mL的离心管中。
4.2.1.2 向上述的液体中加入140μL样品，脉冲涡旋式混匀15s，室温孵育10min，简单离心使离心管顶端液体落到底部。
4.2.1.3 在样品中加入560μL 96%～100%的乙醇，混匀15s，再简单离心。
4.2.1.4 小心将630μL液体加入未浸湿的QIAamp小柱中，盖好盖，离心8000rpm/min，1min，弃去收集管，将柱子置于一新的2mL收集管上。
4.2.1.5 打开QIAamp小柱的盖子，重复步骤6，直至样品全部离心。
4.2.1.6 打开盖子，向柱中加入500μL AW 1缓冲液，盖好盖，离心8000rpm/min，1min，弃去收集管，将柱子置于一新的2mL收集管上。
4.2.1.7 打开盖子，加入500μLAW2缓冲液，盖好盖，离心14000rpm/min，3min。
4.2.1.8 将柱子置于一新的2mL收集管上，空离1min。
4.2.1.9 将柱子置于一新的1.5mL离心管上，加入50μLAVE洗脱缓冲液，室温孵育1min，离心8000rpm/min，1min。
4.2.2 RNeasy MiniKit提取媒介组织标本或血液标本病毒RNA。
4.2.2.1 从Kit中取出RLT液，根据标本数量分装适量RLT液按照1∶100体积比分别加入β-巯基乙醇，分装至相应的预先标记好的微量离心管中，每管600μL。
4.2.2.2 将150μL组织研磨混悬液分别加入相应的RLT液管中，充分混匀。
4.2.2.3 混匀后依次加入750μL 70%的乙醇，充分混匀。
4.2.2.4 从Kit中取出带收集管的滤柱，打开包装将其做好标记。取步骤2中的混合液750μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
4.2.2.5 滤柱仍放回收集管上，将步骤2剩余的混合液全部转入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
4.2.2.6 于滤柱中加入700μLWash Buffer RW 1液，12000rpm，离心15s。
4.2.2.7 从QIAGEN RNeasy MiniKit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，加入500μLWash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
4.2.2.8 弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μLWash Buffer RPE液，13000～14000rpm，离心2min。
4.2.2.9 将滤柱移到一个无RNA酶的干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30～50μL的RNase-freeWater，室温静置1～3min。
4.2.2.10 12000rpm，离心1min，离心液即为病毒RNA，立即检测或-70℃以下保存。
4.3 常规半套式RT-PCR方法检测登革病毒核酸
4.3.1 引物：
引物序列表
4.3.2 PCR扩增：根据实验室内所使用病毒核酸PCR扩增试剂盒特点，正向引物D1和反向引物D2配置第一轮PCR体系，进行第一轮PCR扩增。推荐反应条件为94℃预变性2min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，反应40循环，最后72℃延伸10min。
第二轮分型PCR扩增体系配置采用正向引物D1与反向引物TS1、TS2、TS3和TS4。推荐反应条件为94℃预变性2min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，反应30循环，最后72℃延伸10min。
4.3.3 1.5%浓度琼脂糖电泳分析，确定病毒型别。
4.3.4 结果判读
4.3.4.1 阳性：
1型：电泳显示略小于500 bp的DNA片段。
2型：电泳显示略大于100bp的DNA片段。(https://www.daowen.com)
3型：电泳显示略小于300bp的DNA片段。
4型：电泳显示略小于400bp的DNA片段。
4.3.4.2 阴性：无特异性核酸片段扩增。
4.3.5 意义
阳性结果可以确诊登革病毒感染，可用于登革热早期诊断。
4.4 实时定量RT-PCR法分型检测登革病毒核酸
4.4.1 引物与探针
引物与探针
4.4.2 实时荧光定量RT-PCR扩增
实时荧光定量RT-PCR扩增反应配置体系，参考如下：
RNA模板5μL，酶0.5μL，缓冲液12.5μL，引物各0.5μL（共4对，8条），探针各0.25μL，加水至总体积25μL。
推荐反应条件为50℃，30min；95℃，2min；95℃，15s；60℃，30s反应40个循环。
4.4.3 结果判断
以荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值），以Ct＜35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本，可判断为相应的登革病毒核酸检测阳性。
4.4.4 意义
实时定量RFPCR是一种灵敏、特异、低污染的登革病毒RNA检测方法，可以定性或定量检测登革热患者血清或蚊媒标本中的登革病毒。
附件17 细胞培养分离登革病毒
1 目的
分离登革病毒。
2 适用范围
2.1 无菌采集发病后5日内的登革患者血标本。
2.2 经研磨处理的媒介蚊标本。
3实验前准备
3.1 核对被检样品：患者标本应核对患者的姓名、性别、年龄、编号及检测项目等。蚊媒标本应核对标本种类、编号、性状等。
3.2 生长状态良好的单层登革病毒敏感细胞C6/36，BHK21，VERO等。
3.3 待测样品在检测前应放置于2～8℃冰箱或置于冰上。
4 操作步骤
4.1 取10μL患者血清或蚊悬液20μL用Hank’s液按1∶10稀释至0.1mL或0.2mL备用。
4.2 将在24孔细胞培养板上培养好的单层细胞上清弃掉，用Hank’s液洗涤2遍。
4.3 将稀释好的标本接种细胞，接种C6/36细胞在28℃吸附1小时，BHK21细胞在37℃吸附1小时，补加维持液至1mL，C6/36细胞在28℃培养，BHK21细胞在37℃培养。
4.4 第二天开始观察细胞病变情况。如果没有细胞病变，则盲传3代（每次取细胞悬液0.1mL）接种细胞传代。
4.5 免疫荧光法鉴定登革病毒
4.5.1 细胞抗原片的制备：出现“++”细胞病变的细胞倒去维持液（若盲传无细胞病变出现，仍然按此方法制备），用pH7.2 PBS洗涤2次，加PBS用滴管把细胞从管壁上吹下，吹散，1000 rpm/min离心5min，弃去PBS，细胞沉淀用0.2mL PBS吹散，滴加在抗原片上，吹干，冷丙酮固定10min，PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干备用。
4.5.2 按顺序滴加荧光标记单克隆抗体2孔，对照2孔（加PBS），置湿盒内37℃水浴30min取出。
5.5.3 用PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次，吹干。
4.5.4 荧光显微镜观察结果。
4.6 其他
检测病毒抗原或核酸鉴定登革病毒参见附件2、附件4、附件5。
4.7 结果判断
免疫检测有特异性黄绿色颗粒状荧光，检测出病毒NS1抗原或病毒核酸可确定病毒分离成功。
4.8 意义
从病人血清或蚊媒中分离出登革病毒，可确诊登革感染。
5 废弃物处理
所有实验用品都应严格按照有关传染病处理方法高压处理。
附件18 IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体
1 目的
检测出登革病毒特异性IgM抗体。
2 适用范围
适用于人血清或血浆中登革病毒特异性IgM抗体的快速检测。
3 样品接收和准备
3.1 核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2 待测样品在检测前应放置于2～8℃冰箱或置于冰上。
4 检测项目及参数
本方法检测项目为检测血清或血浆中病毒特异性IgM抗体。
5 检测仪器设备和材料
加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒IgM抗体检测试剂盒，或实验室自备材料：
5.1 抗原：
阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
5.2 抗人IgM（μ链）单克隆抗体或多克隆抗体。
5.3 登革病毒IgM阳性、阴性对照血清。
5.4 辣根过氧化物酶标记登革病毒单克隆抗体。
5.5 缓冲液：
洗涤液：pH7.4 PBS-T（0.05%吐温-20）；
稀释液：pH7.4 PBS（5%牛血清）；
封闭液：pH9.6 碳酸缓冲液（1%牛血清白蛋白）。
5.6 显色液：A/B液。
5.7 终止液：4NH2SO4。
6 检测的环境条件
生物安全二级实验室（BSL-2）中进行，灭活后样本在生物安全一级实验室（BSL-1）内进行。
7 检测原理
本方法采用抗人μ链捕获人血清IgM抗体，加辣根过氧化物酶标记的病毒抗原物，用以检测出血热特异性IgM抗体。具有较高的敏感性、特异性和重复性。适用于出血热的早期特异性诊断及其他实验性研究。
8 检测步骤
8.1 用稀释液按效价稀释抗人μ链单克隆抗体，100μL/孔，加盖，4℃过夜。
8.2 弃去抗人μ链，用洗涤液重复洗3次，甩干，加封闭液，100μL/孔，置37℃水浴孵育2小时。
8.3 弃封闭液，用洗涤液重复洗3次，甩干。
8.4 将待检血清用稀释液从1∶10开始做2或4倍连续稀释，加入酶标板孔中，100μL/孔，同时加入已1∶10稀释的阳性血清、阴性血清对照各4孔，100μL/孔，置37℃水浴孵育2小时。
8.5 弃去血清，用洗涤液重复洗3次，甩干，分别加4个型DV抗原及阴性抗原对照，100μL/孔，4℃过夜。
8.6 弃抗原，用洗涤液重复洗3次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度相应的登革热酶标单克隆抗体，正常抗原加4个型混合的酶标单克隆抗体，100μL/孔，37℃水浴2小时。
8.7 弃去标记物，用洗涤液重复洗3次，甩干，于各反应孔内加A/B液各1滴，37℃，避光3～5min。
8.8 加终止液于每反应孔，1滴/孔。
9 结果判断
（1）目测方法：
阳性对照孔呈明显蓝色，阴性对照孔呈无色，对照成立；若待检血清孔呈明显淡蓝色或深蓝色（TMB），则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。
（2）酶联免疫检测仪检测：
于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）
10 意义
阳性结果，提示患者新近登革病毒感染，用于登革热早期临床诊断。
附件19 酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序
1 目的
检测出登革病毒特异性IgG抗体。
2 适用范围
适用于人血清或血浆中登革病毒特异性IgG抗体的快速检测。
3 实验前准备
（1）核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
（2）待测样品在检测前应放置于2～8℃冰箱或置于冰上。
4 检测项目及参数
本方法检测项目为检测血清或血浆中病毒特异性IgG抗体。
5 检测仪器设备和材料
加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒IgG抗体检测试剂盒，或实验室自备材料：
5.1 抗原：
阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
5.2 辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体。
5.3 缓冲液：
包被液：pH9.6 碳酸缓冲液。
稀释液：pH7.4 PBS（含5%脱脂奶）。
洗涤液：pH7.4 PBS-T（0.05%吐温-20）。
5.4 显色液：A/B液。
5.5 终止液：4N H2SO4。
5.6 酶标板、酶标仪。
6检测的环境条件
生物安全二级实验室（BSL-2）中进行，灭活后样本在生物安全一级实验室（BSL-1）内进行。
7 检测步骤
7.1 用包被液按工作浓度稀释抗原，100μL/孔，4℃过夜。
7.2 弃去包被液，用PBS-T重复洗涤3～5次，甩干。
7.3 将待检血清用稀释液从1∶100开始做2或4倍连续稀释，加入抗原孔，100μL/孔，同时设阴、阳性对照，37℃水浴1小时。
7.4 弃去血清，用洗涤液洗涤5～6次。
7.5 加酶结合物，用稀释液按工作浓度稀释，100μL/孔，37℃水浴1小时。
7.6 弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤6次，甩干。
7.7 加显色液：于各反应孔内加A/B液各1滴，37℃，避光3～5min。
7.8 加终止液于每反应孔，100μL/孔。
8 结果判断
于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为登革热IgG抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）
9 意义
阳性结果，表明曾受到DV感染；恢复期血清抗体阳转，或抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍及以上升高则可确诊。
附件20 免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序
1 目的
免疫荧光法（IFA）检测抗登革病毒IgG抗体。
2 适用范围
适用于人血清或血浆中登革病毒特异性IgG抗体的快速检测。
3 实验前准备
3.1 核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2 待测样品在检测前应放置于2～8℃冰箱或置于冰上。
4 检测项目及参数
本方法检测项目为检测血清或血浆中抗登革病毒IgG抗体。
5 检测仪器设备和材料
5.1 DV1至DV4型抗原片：DV标准毒株感染VERO或BHK21细胞制备，低温干燥保存。
5.2 对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清（阴性对照）。
5.3 羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体。
5.4 常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等。
5.5 荧光显微镜。
6 检测的环境条件
生物安全二级实验室（BSL-2）中进行，样本灭活后可在生物安全一级实验室（BSL-1）内进行。
7 检验步骤
7.1 用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1∶20开始做2倍连续稀释至需要的稀释度。
7.2 取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，风干。
7.3 用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30min（每次试验同时设阳、阴性对照）。
7.4 用PBS震荡洗涤3次，每次5min，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，风干。
7.5 用含1∶30000的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30min，然后同8.4洗涤、漂洗、吹干。
7.6 荧光显微镜观察结果。
8 结果判断
细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞质内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“+”。可参考阳性细胞数：＜25%为“+”，25%～50%为“++”，51%～75%为“+++”，＞75%为“++++”；无特异性荧光者为“-”（阴性）。检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“+”）最高血清稀释度的倒数表示。
9 意义
阳性结果，表明曾受到登革病毒感染，恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件21 伊蚊标本采集与处理操作程序
1 目的
采集登革病毒媒介伊蚊标本，编号、分装和检测前处理。
2 操作步骤
2.1 伊蚊成蚊捕获时间应定在8：30至10：00或18：00至20：00。埃及伊蚊分布区采用入户搜捕的方法，在监测点按东、南、西、北、中方位各选1户，在住户厨房和住房寻找伊蚊，采用电动捕蚊器捕捉，每户12min。白纹伊蚊可在房前屋后周围选择东、南、西、北、中5个捕蚊点，每点12min。
2.2 吸过血的可疑媒介蚊，用0.5mol/L（10%）葡萄糖液喂养，至胃血完全消化。
2.3 按蚊种及捕获地点分组，每10～20只/组，按捕获蚊种类-地点-序列号的规则编号，并填写调查表。
2.4 用含双抗（青霉素、链霉素，终浓度各1000U/mL）的Hank’s液冲洗3次后，用研磨器研碎，每组加含双抗（青霉素、链霉素，终浓度各1000U/mL）的Hank’s液0.5mL，2000rpm/min离心15min，取上清用于登革病毒核酸检测和/或病毒分离。
2.5 如不能及时检测，应将标本保存于-70℃以下冰箱，并记录标本量和盒中位置。
附件22 疑似登革热病人检材送检一览表
送检单位：_______________________________________________________________
送检人：__________________________送检日期：__________________________
接收单位：______________________________________________________________
接收人：_________________________________________________________________
附件23 病原学检测结果一览表
注：对于核酸检测中的序列测定，报送结果中应包括原始测序彩图文件和序列文件的电子版拷贝。
填表时间：________年____月____日单位（盖章）：________填表人：________