【FⅨ基因检测】

标本采集及DNA提取:静脉采集患者外周血3mL,以EDTA进行抗凝。用血液DNA提取试剂盒(美国,promega公司)提取基因组DNA,-20℃保存备用。

引物设计和PCR扩增:根据FⅨ基因序列(Gene Bank 访问号K02402),参照相应文献合成8对引物,8对引物覆盖FⅨ基因的全部外显子区域及其侧翼序列。

PCR反应总体积50μL,上游和下游引物终浓度为0.2μM,4种dNTP终浓度为0.2mM,1×Taq PCR Buffer、1.5mM MgCl2、4U Taq DNA 聚合酶(TAKARA公司)、基因组DNA 50~100ng。所有PCR扩增反应使用美国ABI公司9902热循环仪进行。(https://www.daowen.com)

8对引物使用touch down PCR扩增,PCR反应条件为:95℃预变性5min;前10个PCR循环中,94℃变性30s,60℃(-1℃/cycle)退火45s,72℃延伸45s,继续20个PCR循环,94℃变性30s,51℃退火45s,72℃延伸45s,最后在72℃延伸10min。

PCR产物电泳和测序:使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,使用ABI3100基因分析仪直接测序。测序结果与F9基因标准序列比对后,根据EAHAD Coagulation Factor Variant Databases 及NCBI 数据库判断是否致病位点。