1　材料和方法

1.1 研究对象 随机选择2005年2月至2010年5月,陕西医大血液病研究院接诊的来自全国各地的血友病患者500例为研究对象。其中,男性患者为495例,女性为5例;年龄均值为14岁(0.4~77岁)。按照2000年全国止血与血栓会议诊断标准,血友病A(hemophiliaA,HA)为411例(82.2%)、血友病B(hemophilia B,HB)为79例(15.8%)、多种凝血因子缺乏为10例(2.0%)。先天性血友病为490例(98%)、后天自身获得性血友病为10例(2.0%);先天性中遗传与非遗传血友病患者分别为376例(75.2 %)和114例(22.8%),其中并发同种凝血因子抗体为169例(33.8%)(本研究遵循的程序符合本院人体试验委员会所制订的伦理学标准,得到该委员会批准,分组征得受试对象本人的知情同意,并与之签署临床研究知情同意书)。

1.2 试剂来源 缺乏因子Ⅷ血浆、缺乏因子Ⅸ血浆、缺乏因子Ⅺ血浆及活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT)试剂(美创公司,德国)。0.025 mol/L氯化钙,0.05 mol/L咪唑缓冲液(pH酸碱度为7.37)及正常人混合血浆(质控品,上海太阳生物有限公司)。

1.3 实验方法 采用一期法检测凝血因子活性、Bethesda法检测凝血因子抗体。实验室温度为15~25℃,①用咪唑缓冲液制备1∶1、1∶2和1∶3患者稀释血浆。②温育混合物制备:对照管加入对照质控血浆及缓冲液各0.2 mL;受检管加入1,2稀释血浆及对照质控血浆各0.2 mL;受检管加入1,3稀释血浆及对照质控血浆各0.2 mL。③用一期法测定各种温育混合物的FⅧ:C、FⅨ:C,FⅪ:C。④计算方法:剩余FⅧ:C(%)=温育后FⅧ:C/温育前FⅧ:C×100;FⅨ:C(%)=温育后FⅨ:C/温育前FⅨ:C×100。查表将剩余FⅧ:C或FⅨ,C换算成Bethesda单位(Bu/mL)。

1.4 诊断标准 采用2000年全国血栓与止血会议血友病诊断标准,以FⅧ、FⅨ活性＜45%为诊断标准。血友病分型按照FⅧ:C,FⅨ:C＜2%为重型,2%~5%为中型,6%~25%为轻型,26%~45%为亚临床型。

1.5 病因学分类标准 目前国内外尚缺乏对血友病统一、完整的病因学分类方法。本研究对血友病暂时按照先天和后天的2类及遗传与非遗传、同种与自身获得性4型方法分类。(https://www.daowen.com)

1.5.1 遗传性血友病分类标准 遗传性血友病患者多为男性(女性纯合子型极少见),分类标准如下。①有性联隐性遗传家族史;②临床以负重关节出血畸形及肌肉、深部组织出血为特征;③APTT延长,并可被正常人血浆混合试验纠正,混合曲线呈凹形;④一期法FⅧ:C、FⅨ:C＜45%,其他凝血因子活性正常;⑤血浆凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、出血时间(bleeding time, BT)、血小板数及功能正常,FⅧ,C/vWF:Ag明显降低,FⅧ:Ab或FⅨ:Ab为阴性。

1.5.2 非遗传性血友病分类标准 除无血友病性联遗传家族史及家族FⅧ:C,FⅨ:C检测正常外,非遗传性血友病分类诊断标准与遗传性血友病分类标准相同。

1.5.3 获得性血友病分类标准 获得性血友病可区分为同种(异体)和自身获得性血友病。同种获得性血友病诊断标准:①前提为血友病患者;②多有幼年及反复输注血液制品病史;③临床表现为出血加重,频繁,血制品治疗效果降低或无效;④APTT延长,但立即正常人血浆混合试验不能纠正延长的APTT,混合曲线呈凸形,37℃温育2h混合试验APTT更延长,凸形曲线更明显;⑤FⅧ:Ab或FⅨ:Ab滴度增加。本研究将同种获得性血友病归入先天遗传和非遗传性血友病并发症,便于系统观察自身获得性血友病诊断标准:①非血友病患者突然出现自发性,难以自止,常规止血治疗无效,关节出血较少的出血;②常有产生自身凝血因子抑制物的基础疾病及因素,如老年人、孕/产妇、自身免疫性疾病、肿瘤、手术或外伤后、感染、药物等;③APTT延长,立即正常人血浆混合试验不能纠正延长的APTT,混合曲线呈凸形,37℃温育2h混合试验APTT变化不明显;④常系多种凝血因子降低;⑤凝血因子抑制物除FⅧ:Ab、FⅨ:Ab外,可能为狼疮抗凝物(lupus anticoagulant,LA),ELISA试验可鉴别FⅧ:Ab、FⅨ:Ab和LA。

1.6 统计学分析 本研究数据采用SPSS 10.0统计学软件进行统计学分析。