【FⅧ基因检测】

标本采集及DNA提取:具体方法与FⅨ相同。

F8基因22内含子倒位:采用100μL Bcl I酶切反应体系:DNA 1~2μg,Bcl I限制性内切酶10~20U,1×酶切缓冲液,去离子水补足体积。55℃过夜;酶切后产物经PCR纯化试剂盒(美国,promega公司)纯化;酶切产物用T4 DNA连接酶连接成环状,连接反应体系100μL;纯化产物30μL,T4连接酶10U,10×T4 buffer10μL,去离子水补齐。22℃反应3h,65℃变性10min。连接后经PCR纯化试剂盒(美国,promega公司)纯化。而后参照相应文献合成引物:IU、ID、ED,30μL反应体系:2×mix 15μL、DNA1μL,3种引物各0.8μL、ddH20 14μL。PCR反应条件:94℃5min;94℃ 30s,54℃ 30s,72℃ 1min,35个循环;72℃ 10min。使用1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,判读结果:阳性扩增片段为559bp,正常对照片段仅为487bp,携带者为上述2条带。

F8基因1号内含子倒位:参照相关文献合成2对引物:intlh-1和intlh-2。PCR为25μL反应体系:2×PCRmix12.5μL,DNA 150ng,intlh-1和 Intlh-2引物,终浓度为1μM,ddH2O 6μL。反应条件:94℃ 1min;94℃ 30s,64℃ 30s,72℃ 2min,总共30个循环;72℃ 5min。使用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,并判读结果:intlh-1和intlh-2异常扩增片段长度分别为1.3K及1.8K,正常对照扩增片段长度分别为1.9K及1.2K。

如果22号和1号内含子均未发现异常,则采用FⅧ基因测序,参照相关文献合成26对引物。具体方法同FⅨ基因测序。

2012年陕西医大血液病研究院对接诊的73例血友病患者进行了基因检测,其中血友病A 52例,血友病B 21例,其病因学分类及FⅧ/FⅨ基因突变的类型见表4-6,并发现了22个新的突变基因(表4-7),已呈报世界血友病突变基因库。

表4-6　73例血友病FⅧ/FⅨ基因突变类型及其病因学分类(https://www.daowen.com)

表4-7　陕西医大血液病研究院2012年新发现并已报世界血友病基因库的FⅧ突变基因

续表