五、具体实施例
(一)研究对象
(1)2013年6月至2015年6月,接收住院治疗血友病患者共73例,其中男性69例,女性4例,年龄均值16.13(0.4~83)岁。有出血症状患者37例(50.68%),皮肤及皮下出血者7例,口腔及鼻腔出血者7例,肌肉、关节及腹腔出血各6例,颅内出血3例,消化道出血及尿血各1例。血友病关节炎45例(61.64%);膝、肘、踝、髋、肩、趾关节病变依次为65个、23个、21个、7个、2个、1个,共119个关节。
(2)HA 52例(71.23%),FⅧ:C 1.94±1.59%。其中:先天遗传性42/52例(80.77%),其中重、中、轻型依次为10例、30例、2例,FⅧ:C依次为0.69±0.25%、1.75±0.81%、7.80±1.13%。先天非遗传性3/52例(5.77%),其中重、中、轻型依次为0例、3例、0例,FⅧ:C中型为2.40±1.4%。后天获得性7/52例(13.46%),其中中型7例,FⅧ:C 2.69±1.50%。
(3)HB 21例(28.77%),FⅨ:C 2.13±2.06%。其中:先天遗传性16/21例(76.19%),重、中、轻型依次为5例、10例、1例,FⅨ:C依次为0.58±0.23%、1.86±0.89%、7.0%。先天非遗传性2/21例(9.52%),重型2例,FⅨ:C为0.55±0.07%;后天获得性3/21例(14.29%),中型2例、轻型1例,FⅨ:C依次为:3.80±1.4%、7.5%。
(二)实验方法及步骤
1.FⅧ/FⅨ:C检测:采用MC-1000血凝仪,按说明书操作程序检测凝血因子活性,实验温度控制在15℃~25℃,所用试剂及仪器为:FactorⅧ、FⅨDeficient-Plasma、正常人质控血浆(质控品)、APTT、0.02M氯化钙、通用定标血浆及血凝仪,均来源于德国美创公司和TECO药业。
2.FⅧ/FⅨ:Ab检测:采用改良Nijmegen法检测凝血因子抗体。实验温度控制为15℃~25℃,0.02M咪唑缓冲液,正常人质控血浆及血凝仪均来源于德国美创公司和TECO药业。
3.F9(FⅨ)基因检测方法:采用PCR扩增和测序方法,其中血液DNA提取试剂盒来源于USA Promega公司。引物设计和PCR扩增则依据FⅨ基因序列,参照相关文献,设计、合成8对F9引物见表13-59。
表13-59 HA、HB检测引物列表
续表
续表
PCR扩增使用美国ABI公司9902热循环仪。PCR扩增产物使用1.5%琼脂凝胶电泳检测。
使用美国ABI 3100基因分析仪测序,及优选多重与倒转环化PCR扩增技术检测患者的FⅧ/FⅨ基因突变;继用改良Nijmegen法检测患者的FⅧ/FⅨ:Ab;测序结果与F9基因标准序列比对,依据F9基因数据库(EAHAD Coagulation Factor Variant Databases)及NCBI数据库,判断是否为致病位点。
4.F8(FⅧ)基因检测方法:
(1)F8基因22内含子倒位检测:采用倒转环化PCR扩增(inverseshift-Polymerasecha-in reaction,IS-PCR)技术,其中Bcl I酶切反应体系、酶切后的PCR纯化试剂盒、连接反应试剂、连接后的PCR纯化试剂盒等均来自美国Promega公司。IU、ID、ED引物合成参照文献进行。扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测,使用美国Aplegen凝胶成像分析仪判断结果。
(2)F8基因1号内含子倒位检测:采用多重PCR扩增(multiplex PCR)技术,intlh-1、intlh-2引物合成,参照文献,结果使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测,判断结果。
(3)F8基因测序:如果F8基因22号和1号内含子倒位检测均未发现异常,则进行F8基因测序,并参照文献设计、合成39对、22倒位3条、1倒位4条F8引物,具体方法同F9基因测序。
(三)划分标准
1.血友病分类:采用WFH血友病分型标准,将血友病分为HA、HB。再按凝血因子活性(%)分为:重型＜1%、中型1%~5%、轻型＞5%~≤40%。
2.血友病FⅧ/FⅨ:Ab诊断标准:Ab(Antibody)滴度＞5Bu/mL为高滴度,≤5Bu/mL为低滴度,0Bu/mL为阴性。
3.病因学分类方法:由于目前尚缺乏国际统一标准,本申请则按先天遗传性、先天非遗传性及后天获得性三类进行分类。
先天遗传性:血友病患者与其母亲的FⅧ/FⅨ基因均发生突变,而且突变的位点及类型完全相同;先天非遗传性:血友病患者的FⅧ/FⅨ基因突变,而其母亲的FⅧ/FⅨ基因正常,且无家族遗传史;后天获得性:血友病患者及其母亲的FⅧ/FⅨ基因均正常,且无家族遗传史,无既往异常出血史,但FⅧ/FⅨ:Ab检测常为阳性。
4.纳入标准:对确诊为血友病的患者,在不用FⅧ/FⅨ制剂条件下,先天遗传性患者应用复方血友胶囊,后天获得性患者应用免疫抑制剂20天,资料完整者,纳入观察、统计范围。
5.排除标准:可排除①血管性血友病;②其它凝血因子缺乏症;③年龄＜1岁,不能口服药物的血友病患者;④近期有生命危险,不能完成治疗的血友病患者;⑤3天内应用FⅧ/FⅨ治疗患者。
6.血友病病因学分类方法的具体应用:近年来,经申请人检索发现,现代研究认为肝细胞是人体主要凝血因子合成、产生、调控的靶细胞。相关研究认为人参、黄芪、当归等药,具有促进肝细胞DNA、RNA及蛋白合成作用。白芍具有强烈抑制鼠沙门氏菌突变作用。吗替麦考酚、环磷酰胺、复方甘草酸苷等药具有良好抑制T、B淋巴细胞DNA、RNA及蛋白合成,抑制抗体产生作用。并且申请人通过1000多例血友病临床实践和观察,发现使用非因子药物,不但可以治疗血友病出血,而且也可以提高患者自身FⅧ/FⅨ:C。因此,申请人采用非因子药物,以提高肝细胞功能,防治基因突变及抑制抗体产生为目标,前瞻性制定了血友病病因学分类计划,取得了一定效果,具体实施方法如下:
常用促进凝血因子活性的药物及用法:
一种用于治疗血友病的复方血友胶囊具有促进肝细胞合成及防治基因突变作用,可以提升凝血因子活性。小鼠急毒试验:LD50最大受试药物量为32g/kg,相当生药95.04g/kg,约为临床人拟用量的533倍。在此剂量下未观察到急性毒性反应。
规格:0.3g/粒×40粒/瓶。
用法:成人:1.2g/次,po,tid。疗程:20d。
Compound Glycyrrhizin Injection(日本米诺发源制药株式会社,卫材(中国)药业有限公司,H20190124):具有调节免疫、抗炎、促进肝细胞增生、保护肝脏功能等作用。成人,40mg,iv,gtt,gd,20d 1疗程。
Cyclophosphamide Injection(山西普德药业股份有限公司,H14023686):具有抑制免疫反应作用。成人,200mg加入0.9%氯化钠溶液100mL,iv,gtt,god,儿童10mg/kg。疗程20d。
Mycophemolate Mofetil Capsule(辰欣药业股份有限公司,H20080764):具有抑制免疫反应作用。成人:1g,po,bid;儿童:600mg/m2,po,bid,疗程20d。
2013年6月至2015年6月,对住院治疗的73例确诊的血友病患者,在不用FⅧ/FⅨ替代药物条件下,采用本实施例给出的血友病病因学分类方法,应用非因子药物对血友病进行治疗:即对先天遗传性患者和先天非遗传性患者,口服复方血友胶囊20d,以提升血友病患者的FⅧ/FⅨ:C。对后天获得性患者,采用服用复方甘草酸苷片、环磷酰胺片、吗替麦考酚酯胶囊进行免疫抑制治疗20d,以抑制抗体产生,恢复FⅧ/FⅨ活性。
巩固治疗:出院后带药巩固治疗3个月,先天遗传性患者和先天非遗传性患者继续服用复方血友胶囊。后天获得性患者继续服用吗替麦考酚酯胶囊、环磷酰胺片(成人:50mg/次,2次/d,儿童减量)、美能复方甘草酸苷片(成人50mg/次,3次/d)。
7.疗效判断标准:FⅧ/FⅨ:C、FⅧ/FⅨ:Ab清除及APTT的疗效判断标准:目前国内外尚缺乏血友病统一疗效判断标准。本组采用治疗后与治疗前对比的统计学分析方法。
8.毒副作用与不良反应:通过治疗前、后检查肝肾功、电解质、ECG、血糖、血、尿常规等,观察毒副作用,通过临床观察,判断不良反应。
9.统计学分析:以SPSS18.0统计软件进行统计学分析,组间分析采用配对t检验、Rank试验。P＜0.01为有显著性差异,P＜0.05为有差异。＜5例者,因缺乏统计学意义,故未进行统计学检验。
(四)结果
1.病因学分类:通过检测对血友病患者及母亲FⅧ/FⅨ基因突变的病因学分类:分为先天遗传性、先天非遗传性和后天获得性三类(表13-60),三类发病率依次为79.45%(58/73例)、6.85%(5/73例)、13.7%(10/73例),其中先天性(先天遗传性及先天非遗传性)为86.3%(63/73例),患者与携带者(母亲)FⅧ/FⅨ基因突变比例为58/58例、5/0例、0/0例。FⅧ/FⅨ基因突变类型(表13-61)。并发现了22个新的突变基因(表13-64)。
2.应用血友病病因学分类对73例血友病进行治疗,非因子药物治疗20d,止血有效率100%(37/37例),关节疼痛、肿胀及压痛缓解率100%(45例/45例)。治疗前、后FⅧ/FⅨ:C、APTT、FⅧ/FⅨ:Ab对比,HA和HB的先天遗传、先天非遗传及后天获得性三类均有效,以后天获得性血友病疗效最佳(表13-62)。FⅧ/FⅨ:Ab清除率87.5%(14/16例)。
表13-60 73例血友病FⅧ/FⅨ基因突变病因学分类
表13-61 73例血友病FⅧ/FⅨ基因突变类型
表13-62 73例血友病非因子药物病因学分类治疗20d疗效观察
BT(Before treatment):治疗前;AT(After treatment):治疗后;∗:p＜0.05;∗∗:p＜0.01。
表13-63 73例血友病病因学分类治疗后随访结果
BT(Before treatment):治疗前;AT(After treatment):治疗后;FU(Follow-up):随访;∗:p＜0.05;∗∗:p＜0.01;
表13-64 Mutation Information
续表
3.毒副作用与不良反应:73例血友病住院后采用非因子药物治疗20d,复查肝肾功、电解质、ECG、血糖、血、尿常规等,均正常。临床观察,除5例(6.85%)出现轻度恶心外,其余病例均无不良反应。
4.随访结果:73例血友病患者,出院6个月及12个月后随访,除1例鼻出血、3例Ⅳ级关节炎反复外,其余69例(94.52%)均病情稳定。出院后巩固治疗3个月、6个月及12个月后随访,HA/HB各型FⅧ/FⅨ:C,在不断上升,或稳定状态,以后天获得性最为显著,对预防出血有一定意义。
(五)讨论
关于血友病的治疗,至今仍无根治疗法。通过73例血友病病因学分类研究,其中先天遗传和先天非遗传者占86.3%(63/73例),属于基因突变引起FⅧ/FⅨ:C缺乏;后天获得者占13.70%(10/73例),其中5/10例(50%)属于FⅧ/FⅨ:Ab引起FⅧ/FⅨ:C缺乏,说明血友病的治疗原则应针对基因突变和清除抗体两个方面进行病因学治疗。
根据现代医学研究,认为肝细胞是主要凝血因子合成、产生、调控的靶细胞。中医学也认为血友病与肝、脾、肾三脏器亏损有关。因此,采用复方血友胶囊,通过促进肝细胞功能和防治基因突变的作用,提高凝血因子产生及活性。采用免疫抑制剂清除抗体,恢复FⅧ/FⅨ:C,治疗后天获得性血友病。73例血友病通过病因学分类治疗20d,结果:先天遗传性、先天非遗传性和后天获得性FⅧ/FⅨ活性均较治疗前明显提高,APTT均明显缩短、FⅧ/FⅨ抗体87.5%被清除,以后天获得者最明显。
治疗机理:实验研究证明,采用复方血友胶囊,其中有促进肝细胞、骨髓造血细胞等组织蛋白质、RNA、DNA的代谢与合成,对鼠沙门菌的突变有强烈抑制作用、防治细胞突变作用,以及对染色体损伤有保护作用,从而可能促进FⅧ/FⅨ活性提高。血友病FⅧ/FⅨ:Ab的清除,笔者采用CTX、吗替麦考酚及复方甘草酸苷联合应用,清除抗体,恢复FⅧ/FⅨ:C。该疗法具有一定疗效、经济、安全、便于推广等优点。其次,复方血友胶囊中的甘草(甘草皂苷、甘草次酸)、生地黄亦具有肾上腺皮质激素样作用,可能通过抑制抗体产生,清除抗体,恢复FⅧ/FⅨ:C。关于详细机理,还有待进一步研究。
总之,通过73例血友病研究,验证,说明采用本实施例的检测血友病患者的FⅧ/FⅨ基因突变的引物对血友病病因学分类有指导治疗的意义。采用本实施例给出的血友病病因学分类,对先天遗传性、先天非遗传性及后天获得性血友病,均能提高FⅧ/FⅨ活性,缩短APTT时间,清除抗体,使血友病由重度转变为中度、轻度,甚或FⅧ/FⅨ:C正常,对防治出血、减轻出血反复、预防残疾有一定的理论价值及实际意义,为血友病防治开辟了一条新思路、新途径。
(六)核苷酸或氨基酸序列表
＜110＞陕西医大血液病研究院
＜120＞一组用于检测血友病患者的FⅧ/FⅨ基因突变的引物及其应用
＜160＞
＜210＞ 1
＜211＞20
＜212＞引物HB-1F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CCCATTCTCTTCACTTGTCC
＜210＞ 2
＜211＞20
＜212＞引物HB-1R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CCTAGCTAACAAAGAACAGT
＜210＞ 3
＜211＞ 25
＜212＞引物HB-2+3F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
AGAGATGTAAAATTTTCATGATGTT
＜210＞ 4
＜211＞ 20
＜212＞引物HB-2+3R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GCAGAAAAAACCCACATAAT
＜210＞ 5
＜211＞25
＜212＞引物HB-4F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CTACAGGGGAGGACCGGGCATTCTA
＜210＞ 6
＜211＞24
＜212＞引物HB-4R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
AGTTTCAACTTGTTTCAGAGGGAA
＜210＞ 7
＜211＞ 26
＜212＞引物HB-5F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CATGAGTCAGTAGTTCCATGTACTTT
＜210＞ 8
＜211＞ 26
＜212＞引物HB-5R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TGTAGGTTTGTTAAAATGCTGAAGTT
＜210＞ 9
＜211＞ 20
＜212＞引物HB-6F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TTTAAATACTGATGGGCCTG
＜210＞ 10
＜211＞ 20
＜212＞引物HB-6R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GTTAGTGCTGAAACTTGCCT
＜210＞ 11
＜211＞ 23
＜212＞引物HB-7F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TAGGTCAGTGGTCCCAAGTAGTC
＜210＞ 12
＜211＞ 20
＜212＞引物HB-7R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GTCCCCCACTATCTCCTTGA
＜210＞ 13
＜211＞ 20
＜212＞引物HB-8-1F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TAAGAATGAGATCTTTAACA
＜210＞ 14
＜211＞20
＜212＞ 引物HB-8-1R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CTAAGGTAGTGAAGAACTAA
＜210＞ 15
＜211＞ 20
＜212＞引物HB-8-2F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GAAGAGTCTTCCACAAAGGG
＜210＞ 16
＜211＞ 22
＜212＞引物HB-8-2R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
AAGATGGGAAAGTGATTAGTTA
＜210＞ 17
＜211＞37
＜212＞引物HA-1F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtAGCATCACAACCATCCTAAC
＜210＞ 18
＜211＞37
＜212＞引物HA-1R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacGCACATCCAGTGGGTAAAGT
＜210＞19
＜211＞20
＜212＞引物HA-2F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TGGAAGCATTACTTCCAGCT
＜210＞20
＜211＞20
＜212＞引物HA-2R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
AACTGAAACCTCAAGATTGG
＜210＞21
＜211＞19
＜212＞引物HA-3F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TGCTTCTCCACTGTGACCT
＜210＞22
＜211＞23
＜212＞ 引物HA-3R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
ATCTAGTAAATGTAAGAAATACA
＜210＞23
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-4F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
AGCCCACAGATTTGAAGAGG
＜210＞24
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-4R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
ACGTTGCTGTGAGCCGAGAT
＜210＞25
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-5F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CTTACTGTCAAGTAACTGATG
＜210＞26
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-5R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CTTCATTCCTGAACAGTAATG
＜210＞27
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-6F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TCCCACTTATTGTCATGGAC
＜210＞28
＜211＞18
＜212＞ 引物HA-6R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TACAGAACTGGTGCTGAA
＜210＞29
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-7F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtATAATGTCCCCTTCAGCAAC
＜210＞30
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-7R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacAGCCCAATGTTCTTGATAAA
＜210＞31
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-8F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CCATATAGCCTGCAGAACAT
＜210＞32
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-8R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CTGATGCTCAGCTATGTTAG
＜210＞33
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-9F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtCGAGTTTAGTGGGTGACATT
＜210＞34
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-9R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacTTTAGAGTTGGATTTGAGCC
＜210＞35
＜211＞22
＜212＞ 引物HA-10F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CTAGCCTCAAATTACTATAATG
＜210＞36
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-10R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
ACTTTAGACTGGAGCTTGAG
＜210＞37
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-11F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtAAGGGGACATACACTGAGAA
＜210＞38
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-11R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacGACACTTTCACAGTCAACCG
＜210＞39
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-12F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TGCCATCGCTTTCATCATAG
＜210＞40
＜211＞24
＜212＞ 引物HA-12R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CATTCATTATTATCTGGACATCAC
＜210＞41
＜211＞24
＜212＞ 引物HA-13F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TTCCTGGGAATAAGATAATGG
＜210＞42
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-13R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
AGCATACGAATGGCTAGTGA
＜210＞43
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-14aF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
ACAGGCATAGTACAACAGCA
＜210＞44
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-14aR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CTTGGCTATTCATTAAACCTG
＜210＞45
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-14bF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TCCATCAGACAATTTGGCAG
＜210＞46
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-14bR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞(https://www.daowen.com)
＜400＞
CTACATTTTGCCTAGTGCTC
＜210＞47
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-14CF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtCACTGTATGTATCTGAGGCA
＜210＞48
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-14CR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacAGACAAACAAAACTTCCAAT
＜210＞ 49
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-14dF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
ATCTTCCAGCAGCATCTTAT
＜210＞50
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-14dR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CCTCTACCCTCTTGTAAACC
＜210＞51
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-14eF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtGGATGACACCTCAACCCAGT
＜210＞52
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-14eR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacCCTTCCACGAGATCCAGATG
＜210＞53
＜211＞38
＜212＞ 引物HA-14fF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtTOCCTAOGGAAACTAGCAATG
＜210＞54
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-14fR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacTCACAAGAGCAGAGCAAAGG
＜210＞55
＜211＞40
＜212＞ 引物HA-15F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtATTCCACTGTCCTTAACTCACCA
＜210＞56
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-15R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacACAAAACCCCAGCTTTCATG
＜210＞57
＜211＞37
＜212＞ 引物Ha-15F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtAAAAATTTCCAAAAGTGGGA
＜210＞58
＜211＞37
＜212＞ 引物Ha-15R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacTGGCAAGAGTATTTCAAGGA
＜210＞59
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-16F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtGAACCAGAGTGGATTTCTCA
＜210＞60
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-16R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacGAACCAGAGTGGATTTCTCA
＜210＞61
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-17F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TGTCATTACTGACTGGAATCT
＜210＞62
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-17R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CACTCCCACAGATATACTCT
＜210＞63
＜211＞38
＜212＞ 引物HA-18F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtCCCAGTGCCTAGACCATTTAA
＜210＞64
＜211＞38
＜212＞ 引物HA-18R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacTTGATCCAGGGACTTGAACAT
＜210＞65
＜211＞26
＜212＞ 引物HA-19F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CGCATAAACCAATGTATCTCATGCTC
＜210＞66
＜211＞22
＜212＞ 引物HA-19R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TCCTGACACAAGCAACCATTCC
＜210＞67
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-20F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GACGTTCTCCCATTTTCATTG
＜210＞68
＜211＞28
＜212＞ 引物HA-20R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GGATTCATTATCTGAGATTCTCCACCAG
＜210＞69
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-21F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CAGCTTAGATTAACCTTTCTC
＜210＞70
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-21R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GAGTGAATGTGATACATTTCC
＜210＞71
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-22F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TCAGGAGGTAGCACATACAT
＜210＞72
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-22R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GTCCAATATCTGAAATCTGC
＜210＞73
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-23F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GTCTTATGTAGATGTTGGATG
＜210＞74
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-23R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
AGTCTCAGGATAACTAGAACA
＜210＞75
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-24F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GCTCAGTATAACTGAGGCTG
＜210＞76
＜211＞24
＜212＞ 引物HA-24R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CCCATAACCAAACTTCCTTGACAC
＜210＞77
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-25F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
AGTGCTGTGGTATGGTTAAG
＜210＞78
＜211＞22
＜212＞ 引物HA-25R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TTGCTCTGAAAATTTGGTCATA
＜210＞79
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-26AF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtCTCTGAGAGGCCTAACTTTT
＜210＞80
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-26AR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacATCCTGGACTACTGGAAACA
＜210＞81
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-26bF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtGGAGAAACCTGCATGAAAGC
＜210＞82
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-26bR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacTTGGCCATCACAAATTTCAA
＜210＞83
＜211＞38
＜212＞ 引物HA-26cR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtTGCAAATGTGCATTTTTCTGA
＜210＞84
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-26cF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacCCTCCAGCCCCCTTTACTAT
＜210＞85
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-26dF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtCCACCCCCATAAGATTGTGA
＜210＞86
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-26dR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacCTGAAGAAACCAGCAGGAAAA
＜210＞87
＜211＞38
＜212＞ 引物HA-26EF 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtTCTTGCTATTCAGTGCCCCTA
＜210＞88
＜211＞40
＜212＞ 引物HA-26ER 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacGCTTGACCCTTATCTGACCTCTT
＜210＞89
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-P1F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtACAGAAAGAAGCAGGTGGAG
＜210＞90
＜211＞36
＜212＞ 引物HA-P1R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgac GAAGAGGGTTGGAGTAGGC
＜210＞91
＜211＞39
＜212＞ 引物HA-P2F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagt GAGGGATGGAGAAGTCAAAGTG
＜210＞92
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-P2R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacGAAATCTGGGGGAAAGGTGT
＜210＞93
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-P3F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
gtagcgcgacggccagtACCTCAACACTTGCTATTTC
＜210＞94
＜211＞37
＜212＞ 引物HA-P3R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
cagggcgcagcgatgacAGTGTTTATCAAAGGGGCT
＜210＞95
＜211＞33
＜212＞ 引物HA-P 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TGCCTGTCCATTACACTGATGACATTATGCTGA
＜210＞96
＜211＞34
＜212＞ 引物HA-Q 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TACAACCATTCTGCCTTTCACTTTCAGTGCAATA
＜210＞97
＜211＞34
＜212＞ 引物HA-B 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CCAAACTATAACCAGCACCTTGAACTTCCCCTCTCA
＜210＞98
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-9F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GTTGTTGGGAATGGTTACGG
＜210＞99
＜211＞20
＜212＞ 引物HA-9cR 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
CTAGCTTGAGCTCCCTGTGG
＜210＞100
＜211＞21
＜212＞ 引物HA-intlh-2F 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
＜210＞101
＜211＞24
＜212＞ 引物HA-intlh-2R 序列
＜213＞ DNA
＜220＞
＜400＞
TGGGTGATATAAGCTGCTGAGCTA