双光子激光扫描共聚焦显微镜在皮肤肿瘤诊断方面的应用

临床上皮肤肿瘤微创诊断的需求极大地促进了双光子激光扫描共聚焦荧光成像技术的发展。按照发生率由高到低排列，皮肤肿瘤的类别如下：基底细胞癌（起源于构成表皮基底层的细胞）、鳞状细胞癌（起源于鳞状细胞，构成表皮的主要部分）和黑素瘤（起源于黑素细胞）。尽管黑素瘤病例的比例相对较低，但它的死亡率却最高。Teuchner等最早于1999年利用双光子荧光共聚焦显微镜观察了皮肤组织切片中黑素的双光子荧光。随后，Skala等研究了仓鼠颊囊癌（一种鳞状细胞癌）模型，并对肿瘤进行活检和三维成像。从这些图像中，鉴定出五个特征来区分正常、癌变前和癌变组织。随后，这项工作扩展到包括基于NADPH和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的荧光寿命代谢成像，并指出肿瘤中的代谢与正常组织不同。

人体组织的研究是朝着最终临床应用迈出的重要一步，这些研究大多数基于内源性荧光团的双光子荧光。Cicchi等在基底细胞癌的概念验证研究中，观察到患者癌变组织中荧光强度增高的现象。Riemann等利用NADPH和弹性蛋白的荧光以及胶原蛋白的SHG信号对黑素瘤进行了荧光成像，观察到黑素瘤细胞发射的荧光强度大大高于周围的正常细胞。另外，Koenig等通过对250例黑素瘤患者癌变组织的荧光成像观察，进一步证实了癌变黑素细胞发射的荧光强度增高，并且还观察到细胞形态的差异。癌变黑素细胞相比正常细胞拉长，而且倾向于一起迁移。一项招募了115例患者的大型研究，评估了双光子荧光成像诊断黑素瘤的灵敏度和特异性，其灵敏度高达95％，特异性高达97％（图5-6）。因此，双光子荧光成像是一种有前途的无创诊断方法，其提供的形态学和分子信息与切除活检类似，具有诊断意义。(https://www.daowen.com)

图5-6　黑素瘤的原位光学显微镜图像
（a）上表皮角质层内出现荧光强度增高的黑素细胞（白色箭头）；颗粒层（b）和棘突层（c和d）的特征表现为具有较大的细胞间距离和轮廓不清晰的角质化细胞边界；棘突层（c和d）多观察到细胞碎片、多形细胞（星号）和树枝状结构（白色箭头）。标尺：40 μm
Figure 5-6　Optical sectioning of melanoma
Ascending highly fluorescent melanocytes（white arrows）appear within the upper epidermal layers，for example，stratum corneum（a）.Large intercellular distance and poorly defined keratinocyte cell borders characterize the stratum granulosum（b）and stratum spinosum（c and d）.Cell fragments，pleomorphic cells（asterisk）and dendritic structures（white arrows）were frequently found in the stratum spinosum（c and d）.In vivo，scale bar：40 μm(https://www.daowen.com)