第七节　拉曼成像

拉曼光谱技术基于印度物理学家Raman于1928年发现的拉曼散射效应，是一种常用的振动光谱技术。由于拉曼谱图中特征峰的位置、强度和宽度等能够有效地提供物质分子的指纹信息，而且特征峰的强度具有浓度依赖性，因此拉曼光谱也是一种定量分析方法。相比于其他光谱技术，拉曼光谱有其独特的优势：可以通过改变激发波长来选择性地激发分子的所需部分；不需要任何样品预处理，测量过程中样品也不会被破坏；由于水的拉曼光谱带小到可以忽略不计，因此在测量含水样品或水溶液的拉曼信号时也比较容易。拉曼光谱在长波方向上有较宽的测量范围，能够提供一些重原子的振动情况。在拥有诸多优势的拉曼光谱基础上衍生出了各种各样的新型分析技术，如表面增强拉曼光谱技术（SERS）、傅里叶变换拉曼光谱技术（FT-Raman）、共振拉曼光谱技术（RRS）、显微共聚焦拉曼光谱成像技术（CRMI）和相干拉曼散射显微术（CRSM）等。

CRMI是在显微共聚焦光路的基础上结合拉曼分析发展起来的一种检测技术。共聚焦技术使得只有聚焦平面的信号被共聚焦针孔接收，而聚焦平面以外的信号将被滤除，因此大大提高了信号质量，增高了信噪比。这项技术可对微小样品甚至单细胞水平的样品进行探测，配置高倍率光学显微镜及多种类型的激发光源，具有高空间分辨率、高信噪比、高准确率等优点，可进行逐点扫描并获得样品的显微拉曼图像。这些年来，CRMI在肿瘤检测、文物考古、公安法学等领域得到了大力发展。在用拉曼光谱对生物组织进行成分分析时，一些不确定性因素如生物组织结构不均匀和化学组成复杂会对结果造成影响。融合了拉曼光谱和显微成像两种分析方法的优点的CRMI，能够有效弥补这些不确定性因素所导致的认知局限，它是一种研究生物组织的生化成分与组织结构特点的分子量级光学成像方法。图5-16（a）所示为CRMI系统的简化示意图。由于弱的拉曼散射（斯托克斯和反斯托克斯位移），CRMI系统的激光光源比普通吸收光谱弱，约为其的百万分之一。分束器将光分开，光束路径通过物镜聚焦到样品上。光束可以分别在相机和光谱仪上进行观察或测量，并且在通过带阻滤波器去除瑞利散射之后，斯托克斯（和反斯托克斯）波长的光经过光栅衍射到检测器（或CCD或InGaAs阵列）上。CRMI凭借不需要样品预处理的独特优势以及与常规显微镜相比能够提供更高的轴向和空间分辨率的能力，可以对细胞或生物组织的自然状态进行非常详细的分析。在细胞生命周期、细胞受损或癌变时及时观察到生化成分含量及分布的改变情况对研究人员来说是非常有价值的。使用CRMI，不仅可以随时监测各种组织或细胞的变化，而且能够进行健康组织与癌变组织间的差异分析。

图5-16　CRMI系统的简化示意图（a）和皮肤组织内生物分子的特征拉曼光谱（b）
Figure 5-16　Schematic diagram of confocal Raman microspectral imaging（CRMI）（a）and characteristic Raman spectra of biomolecules in skin tissue（b）

皮肤由蛋白质、核酸、糖、辅酶等成分组成，是人体最大的器官，主要作用是保护体内器官和组织不受外界物理化学刺激以及病原体等的影响。皮肤组织由表皮、真皮、皮下组织组成，还包括一些附属器（如汗腺、皮脂腺、指甲）、血管、淋巴管、肌肉等。各层组织、细胞形态和生物功能各不相同，但其含有相同类型、不同拉曼光谱特征的生物分子。在实验中，通过研究各层皮肤组织的拉曼光谱特征，能够描述不同皮肤层中所具有的化学组分差异。例如，角质层和表皮层之间主要的光谱差异表现在1062 cm-1、1126 cm-1、1296 cm-1处，表明了大量神经酰胺分布于角质层中。相比于拉曼光谱分析技术，CRMI研究离体皮肤组织的拉曼光谱特性，将含有大量化学成分组成信息的拉曼光谱浓缩为高信息内涵的光谱图像，能够更为直观地呈现皮肤组织内部不同的化学成分以及其相对含量差异，更有利于归纳分析皮肤组织内部的生化组成特性。