消化后离心沉淀法
（一） NaOH消化离心沉淀法
适用于所有标本的消化处理。
1.试剂配制
（1） 2%～4% NaOH溶液：取2 ～4 g NaOH加入80 ml灭菌新鲜制备蒸馏水中，完全溶解后补充蒸馏水至终体积100 ml，冰箱冷藏保存。
（2） pH6.8磷酸盐缓冲液（PBS）：将KH2PO4 45.59 g和Na2HPO4 · 12H2O 119.977 g溶解于1 000 ml蒸馏水中，配制成10倍磷酸缓冲液储存液，取100 ml储存液加到900 ml蒸馏水中，分装后高压灭菌备用。
试剂配制注意事项：一定要用新鲜制备的蒸馏水配制，放置时间久的蒸馏水中可能含有非结核分枝杆菌，涂片镜检时易造成假阳性结果。
2.呼吸道标本的处理
（1） 脓痰需加2 ～3倍体积的2%～4% NaOH消化液；黏液痰加入1 ～2倍体积的消化液；稀薄痰则加等量消化液；支气管灌洗液、支气管刷取物、胃液先离心15 min，离心力为3 000 ～3 800 g，弃上清，加入5 ～10 ml 2%～4% NaOH消化液。
（2） 涡旋振荡器上振荡22 s左右，直至标本充分液化。
（3） 加入pH为6.8的PBS（0.067 mol/L）缓冲液或蒸馏水至50 ml标记的刻度，上下颠倒混匀。
（4） 3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清。
（5） 取沉淀物1 ～2滴制成10 mm×20 mm椭圆、厚薄适度的涂片，备染色用。
注意事项：① 糊状沉淀物取1滴涂片，充分涂抹开，用棉签蘸取多余标本，否则痰膜易脱落。② 标本离心好后，要立即取出离心管，看着离心管底部的沉淀物，轻轻倒掉上清液，一旦沉淀悬浮起，要立即将离心管直立，用吸管小心吸取上清，留下沉淀。③ 离心力至少为3 000 g，离心15 min。④ 标本加消化液总体积不要超过20 ml。
3.脓液的处理 取1 ～2 ml脓液标本，加入5 ～15 ml 2%～4% NaOH，涡旋震荡至完全液化，静置15 ～20 min，加无菌PBS（pH6.8）或蒸馏水至50 ml混匀，3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清，若沉淀物少，取1 ～2滴涂成厚薄均匀10 mm×20 mm卵圆形，备染色用。若沉淀物较多，则用吸管加3滴蒸馏水或生理盐水或PBS混匀，取1滴涂成厚薄均匀10 mm×20 mm卵圆形，备染色用。
注意事项：① 标本量1 ～2 ml为宜，否则过多标本不易液化。② 涂片易薄不易厚，厚涂片会出现染色时涂膜脱落，镜检时造成假阴性。
4.骨髓、淋巴穿刺液、肺穿刺液的处理 对于肺穿刺液，通过NaOH消化溶解红细胞，与直接涂片法相比，阳性率可由6%提高到50%左右。淋巴穿刺液经NaOH消化处理，涂片阳性率为70%左右。对于血性标本，破坏红细胞是关键。
（1） 稀薄血性标本等量加入2%～4%的NaOH，消化其中的凝块或血液；浓厚的血性标本，加入3 ～4倍体积的2%～4% NaOH。
（2） 涡旋震荡，将未消化的凝块用两根竹签固定，沿管壁研磨，静置15 ～20 min。
（3） 加无菌PBS（pH6.8）或蒸馏水至50 ml。
（4） 3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清。
（5） 若沉淀物少，取1 ～2滴涂成厚薄均匀10 mm×20 mm卵圆形涂片，备染色用。
（6） 若沉淀物较多，则用吸管加3滴蒸馏水或生理盐水或PBS混匀，取1滴涂成厚薄均匀10 mm×20 mm卵圆形，备染色用。
注意事项：① 若沉淀呈褐色，再加溶痰剂5 ml，消化至透明澄清，离心，弃上清，加入1 ～2滴（血浆与蒸馏水按1 ∶15稀释配制）稀释血浆，涂片。② 比较浓的血性穿刺液初次消化，一定要用NaOH消化，不宜先用溶痰剂。
5.尿标本的处理 传统的尿标本处理方法为离心后，取沉淀物直接涂片，染色过程中标本易从玻片上脱落，是造成涂片阳性率低的主要原因。尿标本离心后，将沉淀物用NaOH消化，可避免染色时标本脱落，阳性率可达50%左右，具体操作步骤如下。
（1） 先将50 ml左右尿液3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清。
（2） 加入5 ～10 ml 2%～4% NaOH，涡旋震荡至完全液化，静置15 ～20 min。
（3） 加蒸馏水或无菌PBS（pH6.8）至50 ml。
（4） 3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清。
（5） 取1 ～2滴涂成厚薄均匀10 mm×20 mm卵圆形，备染色用。
注意事项：① 若尿离心后沉淀很多，建议加5 ml左右的溶痰剂处理，离心弃上清后加1 ∶15的血浆1 ～2滴，吹打均匀后涂片；② 若尿沉淀物加入NaOH后，标本变为黏稠，建议临床重新留取一份尿液，离心后用5 ～10 ml的溶痰剂处理；③ 推荐荧光染色，LED显微镜镜检。
6.粪便标本的处理
（1） 将标本与5 ～10 ml 2%～4% NaOH混合，振荡7 s。
（2） 吸取上清5 ml左右，加蒸馏水或无菌PBS（pH为6.8）至50 ml。
（3） 3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清。
（4） 取1滴涂成厚薄均匀10 mm×20 mm卵圆形，备染色用。
注意事项：若涂片太厚，可用吸管垂直于玻片，倒吸一部分标本弃去，或用棉签吸取多余标本。
7.胸、腹水标本的处理 传统方法离心后弃上清，取沉淀涂片，染色过程中标本易从玻片上脱落，是造成涂片阳性率低的主要原因，传统方法阳性率＜5%。胸腹水经NaOH消化后离心沉淀涂片，阳性率可达30%左右。
（1） 先将胸腹水中的凝块或絮状物吸出至另一试管。
（2） 剩余部分3 000 ～3 800 g离心15 min，弃去上清液，与上述凝块混合成一管。
（3） 加10 ～15 ml 2%～4% NaOH消化40 ～60 min至透明。
（4） 加无菌PBS（pH6.8）或蒸馏水中和至50 ml。(https://www.daowen.com)
（5） 3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清。
（6） 混匀沉淀，取1滴制成厚薄均匀、卵圆形10 mm×20 mm涂片，备染色用。
注意事项：① 次氯酸钠（溶痰剂）不适合用于消化胸、腹水，否则标本染色时不易脱色，无法镜检。② 标本离心后，一定要消化处理或蒸馏水洗涤处理，否则染色时标本易被冲洗掉，降低镜检阳性率。
8.脑脊液标本的处理 结核性脑膜炎患者的脑脊液，蛋白含量高，若离心后直接涂片，染色时标本易脱落，降低涂片的阳性率。用NaOH消化处理或蒸馏水洗涤，阳性率可达30%左右。
（1） 若脑脊液为无色透明、无絮状物，3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清，加3滴PBS或蒸馏水稀释标本中蛋白浓度，将沉淀部分混合均匀，取1滴制成厚薄均匀、卵圆形10 mm×20 mm涂片，备染色用。
（2） 若为淡黄色或有絮状物，加等量的2%～4% NaOH消化至絮状物消失，加3 ～4倍的无菌PBS（pH6.8）中和或蒸馏水稀释碱性，3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清，混匀沉淀，取2 ～3滴制成厚薄均匀、卵圆形10 mm×20 mm涂片，备染色用。
注意事项：含絮状物的脑脊液，一定要NaOH消化处理，否则染色过程中标本易脱落。
9.拭子的处理
（1） 加入2 ～3 ml 2%～4% NaOH于装有拭子的离心管中。
（2） 涡旋震荡，静置15 ～20 min。
（3） 将拭子沿管壁挤压出多余水分，弃去拭子。
（4） 加无菌PBS（pH为6.8）中和或蒸馏水至15 ml。
（5） 3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清。
（6） 将沉淀部分混合均匀，取2 ～3滴制成厚薄均匀、卵圆形10 mm×20 mm涂片，备染色用。
10.NaOH消化离心沉淀法操作注意事项
（1） 标本离心结束后，立即倒掉上清，动作要轻，看着沉淀慢慢倒，一旦沉淀悬起，要用吸管慢慢吸取上清，弃去。若离心后，长时间未倒掉上清，沉淀在倾倒过程中易悬浮。
（2） 若为肺外标本，同一标本一张玻片涂两个，一个厚些，一个薄些。
（3） 建议离心速度至少要3 000 g以上，最好3 800 g。
（4） 一定要使用尖底离心管离心标本。平底离心管倾倒上清时，沉淀易悬浮被倒掉。
（5） 对于糊状沉淀，取1滴沉淀涂片，用棉签轻轻蘸取玻片上多余标本，避免染色时涂膜脱落。
（二） 次氯酸钠消化离心沉淀法
由于漂白水或5%～6%次氯酸溶液能杀死大部分微生物及标本内的结核杆菌，若标本仅用于抗酸杆菌涂片，可利用次氯酸消化法，以降低操作者被感染的危险性。利用本方法处理可不在生物安全柜内操作，但若处理时间超过15 min以上时，会造成抗酸杆菌分解，所以标本处理时应注意时间不可过长。
1.试剂 ① 贝索溶痰剂，主要成分次氯酸钠，室温保存。② 1∶15血浆：2 ml献血者血浆加蒸馏水至30 ml，冰箱冷藏保存。
2.标本类型 呼吸道标本、尿。
3.标本处理
（1） 脓痰或黏稠痰，加入3倍体积溶痰剂；黏液痰加入2倍体积溶痰剂；稀薄痰则加等量溶痰剂；口水痰加3 ～4滴溶痰剂（以痰液彻底液化为准）；少量的灌洗液、支刷物、胃液处理同稀薄痰液，如果量超过10 ml，处理同尿标本，先3 800 g离心15 min，弃上清，沉淀物中加入5 ml左右的溶痰剂。
（2） 涡旋震荡，至完全液化（查看管底有无黏液）。
（3） 3 000 ～3 800 g离心15 min，弃上清。
（4） 加入1 ～2滴（1 ∶15）血浆，吹打均匀。
（5） 若沉淀物颜色为乳白色，取1滴制成10 mm×20 mm椭圆的涂片，再将吸管垂直于玻片，吸去多余标本；若沉淀物为清亮或稍混浊的液体，取1 ～2滴制成10 mm×20 mm椭圆、厚薄适度的涂片，备染色用。
4.溶痰剂消化法操作注意事项
（1） 一定要使用尖底离心管离心标本；平底离心管倾倒上清时，沉淀易悬浮被倒掉。
（2） 倾倒上清结束时，最后再轻轻甩2 ～3下，尽量将上清液去除干净。
（3） 溶痰剂处理标本，涂片宜薄不宜厚，一般取1 ～2滴涂片，当沉淀为明显浑浊，取半滴涂片（1滴涂片后，再将吸管垂直于玻片，倒吸多余标本）。涂片太厚，染色时标本易脱落，镜检时，非特异性抗酸物质增加，干扰镜检，造成漏检。
（4） 沉淀中加入1 ～2滴（1 ∶15）血浆，可减少涂片在染色时标本脱落，背景易观察。
（5） 溶痰剂处理标本荧光染色时，第三液用0.3%亚甲蓝而不是高锰酸钾，可以减少非特异性荧光。
（6） 溶痰剂处理标本荧光染色时，个别标本存在较多非特异性荧光，或出现较亮、菌体特别短的现象，建议用高倍镜镜检。镜检时存在非特异性抗酸阳性物质，报告典型形态的抗酸杆菌。
（三） NaOH与溶痰剂处理呼吸道标本优缺点比较
见表5—1—6—1。
表5—1—6—1 NaOH 与溶痰剂处理效果比较
