附录四 分枝杆菌检测常见问题解答
1.是什么原因造成假阳性呢？脱色没脱干净吗？
答：造成假阳性的原因有以下5个。① 第一液加的量少，在染色期间出现干燥。② 冲完第一液后，未将水沥干，脱色液加的量少，脱色时间短（一般脱色2 min），脱色不彻底。③ 痰液中有食物残渣。④ 玻片有划痕，易被误认为阳性。⑤ 染色结束取涂片时，手套上污染的第一液又流到涂片上。
2.溶痰用的次氯酸钠的浓度多少？结核分枝杆菌抗酸染色阳性，弱抗酸染色也是阳性吗？
答：一般为5%的浓度，结核分枝杆菌弱抗酸染色也是阳性。
3.我们用夹层杯，胸腹水和脑脊液一定要NaOH处理吗？
如果用夹层杯制作的片子，脱色时没有涂膜脱落现象，可以不用处理。
4.请问所有离心操作都是加盖离心吗？
答：离心时会产生气溶胶，为了生物安全，建议低温离心，带安全罩。
5.蒸馏水最好要新鲜的，新鲜蒸馏水如何获得呢？灭菌后放置一段时间的可以吗？
答：新鲜蒸馏水可以从生化用纯水机中制取，灭菌后可以放置在冰箱中一段时间。
6.请问多次离心会增加感染的机会吗？
答：是的，可以考虑购买带安全罩的低温离心机。
7.我们用的是消化离心夹层杯法，试剂商说NaOH能杀死抗酸菌。对此我表示怀疑，然后做了三次试验，将消化后的标本去培养，其中有两次是培养阴性，一次培养阳性。因此，我想知道NAOH到底能不能杀死抗酸菌？
答：不同浓度NaOH，能杀死20%～90%的分枝杆菌。
8.即时痰、夜间痰和晨痰，这三类标本哪种阳性率高？
答：晨痰阳性率高。
9.没有NaOH，用KOH可以吗？浓度也一样吗？胸腹水加抗凝剂是否会影响培养？还是说加抗凝剂仅用于结核涂片？
答：文献中均为NaOH消化，我们没试过KOH消化，可以试试看。加抗凝剂是否会影响培养，肝素和SPS抗凝不影响培养，EDTA抗凝会影响培养。
10.请问痰液所用离心管是哪种类型？
答：50 ml尖底离心管。
11.您提及用晨尿可以提高阳性率，但在菌量少的情况下，是不是像书里讲的留24 h的尿，但没有防腐有影响吗？肝素抗凝的标本会不会影响一般细菌培养？（因为我们做一般细菌培养还要做涂片，医生会送一无菌管的尿给我们）
答：涂片可以使用24 h尿液，但要注意冷藏和无菌操作，不要加防腐剂。用肝素和SPS抗凝不会影响一般菌培养。
12.水洗标本时蒸馏水用40～50 ml，用什么容器离心？我们就是一般离心机，怎么用？(https://www.daowen.com)
答：可以先将标本倒入15 ml尖底离心管，如果标本量多时，可用多个离心管离心。离心后，去上清，集中到一管，再用蒸馏水加至15 ml，混匀，离心，去上清，加3滴蒸馏水混匀涂片。
13.细胞离心机对提高脑脊液结核分枝杆菌检出率有何影响？
答：有文献报告可以提高结核分枝杆菌检出率。
14.实验室的许多小离心机上面的数值都可以达到3 800 g，可信吗？
答：这个问题可以咨询厂商，我们用的是可以放50 ml尖底离心管的进口低温离心机。
15.次氯酸钠消化痰需要多长时间？
答：我们一般为5 ～10 min。不可以超过15 min，时间过长易造成菌体破坏。
16.抗酸杆菌的室内质控怎么做？
答：① 自查和互查：抽查复检当日10%涂片，并做登记。要求：抗酸杆菌阳性片符合率≥98%，阴性片符合率≥96%，不允许“1+”以上的阳性片出现假阴性。② 涂片脱落面积应在10%以下。③ 抗酸染色每日染自制的阳性和阴性质控片，荧光染色每批次均要染自制的阳性和阴性质控片，监测染液质量和染色效果是否合格。
17.请问直接涂片法在生物安全柜紫外灯照射1 h后可以把结核分枝杆菌杀死吗？在基层医院，工作量大、人员不足的情况下，如何做到自身保护？需要注意哪些问题？
答：① 不能杀死。结核分枝杆菌对紫外线敏感，日光照射2 h以上可杀灭暴露在物体上的细菌，紫外线灯照射可杀灭物体表面和空气中的结核分枝杆菌，但紫外线穿透力弱，难以透入固体物质内部和液体深层，直接涂片标本需要照射2 h才有可能杀死结核分枝杆菌。② 标本处理及结核分枝杆菌涂片染色、培养和药物敏感实验、免疫血清学检查等检测，可在生物安全二级实验室进行。③ 实验室配置生物安全柜、低温冷冻离心机、N95口罩、一次性防护衣、一次性鞋套、一次性帽子，最好配备负压实验室。不要边加热边涂片，涂片自然干燥后固定染色。
18.次氯酸钠需灭菌吗？
答：不需要，它本身为消毒剂。
19.5%的次氯酸钠溶液可以用84液配置吗？
答：没试过，最好购买商品化的试剂。
20.骨与关节结核感染临床诊断非常困难，我们实验室经常收到关节液或术中组织，这两种标本结核分枝杆菌涂片方面有什么经验或方法可以提高阳性率？
答：关节液如果不是脓性，可以参照胸腹水涂片方法；如果是脓性，用2%～4%的NaOH消化，再用蒸馏水或PBS稀释碱性，离心，去上清，加3滴蒸馏水混匀涂片，切记涂片要薄。如果是组织，可以用剪刀剪碎，再用2%～4%的NaOH消化，消化时间1 h左右，后续操作同脓。记住剪刀用后要用乙醇消毒，流水多冲洗几遍，防止交叉污染。
21.请问涂片用的血浆可以使用血生化或者血常规检测时采集的血浆吗？另外，你们的抗酸染色用仪器和手工染色两者阳性率有区别吗？
答：血浆建议用血库献血者的血浆，我们曾经做过患者的血液抗酸杆菌涂片“1+”的结果。如果用患者血浆稀释后做涂片抗酸杆菌镜检阴性，可以使用。仪器染色和手工染色阳性率区别没研究过，我们偶尔使用仪器染色，出现过涂膜脱落现象。
22.结核病实验室诊断面临的挑战是什么？
答：① 涂片简单易操作，但阳性率低，待研发能提高涂片阳性率的标本前处理方法和抗酸染色方法。② 培养敏感，但培养阳性需要时间长，好多实验室存在过度消化，结核分枝杆菌被杀死或培养污染率高，结核分枝杆菌被抑制，技术人员规范操作待提高；培养前理想的标本处理方法待研发；既能提高培养阳性率又能缩短培养时间的培养基待研发。③ 分子生物学方法阳性率高于涂片法，但低于培养，存在假阳性和假阴性现象；操作简便快速，敏感性高的分子方法待研发。
（钱雪琴）