分枝杆菌培养去污染方法
（一） 4% NaOH法
NaOH作为一种强碱性试剂，既能起到杀灭微生物作用又能去除痰液中的黏液使其液化，实验室通常使用终浓度为2% NaOH溶液去污染，与标本作用时间不可超过15 min，具体操作步骤如下。
1.向标本中添加等量体积的新鲜配制4% NaOH溶液，如标本量超过10 ml，可将10 ml脓性、血性部位样本转移至50 ml螺口离心管内，加入10 ml NaOH溶液。如污染率超出范围，可增加NaOH溶液终浓度至3%，但不可增加消化时间；
2.拧紧管盖涡旋震荡22 s；
3.室温静置15 min，取100 μl直接接种酸性罗氏培养基或者继续下面操作；
4.用0.67 M磷酸盐缓冲液（pH6.8）稀释混合液至50 ml；
5.旋紧管盖颠倒混匀数次；
6.3 000 g离心力离心至少15 min；
7.将上清液转移至装有消毒剂的废液容器；
8.向沉淀物中加入1 ml 0.67 M磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水，旋紧管盖混匀，作为接种培养物；
9.将培养物接种至合适的培养基进行培养；
10.制作涂片，固定后抗酸染色镜检。
（二） 2% NaOH —0.5% NALC法
单独使用2%的NaOH溶液会对结核分枝杆菌产生杀伤作用，通过加入0.5%～2%的黏液溶解试剂NCLC（N—乙酰半胱氨酸），可以实现快速消化黏液和去污染的同时保护结核分枝杆菌少受损伤。磷酸盐缓冲液可稀释处理液，减低密度，使抗酸杆菌更有效地沉淀。NaOH—NALC法可以用来处理多种标本，包括胃灌洗液、组织液、粪便、尿液及其他体液标本。NaOH最终浓度为1%～2%，大多数实验室选择终浓度为1%。为了防止污染率的上升，可以适当增加NaOH浓度，但处理消化的时间绝不可以超过15 min。具体操作步骤如下。
1.向标本中添加等量体积的NaOH—NALC溶液，如标本量超过10 ml，可转移10 ml血性部位样本至50 ml螺口离心管，加入10 ml NaOH—NALC溶液；
2.旋紧管盖涡旋震荡22 s；
3.室温静置15 min；
4.用磷酸盐缓冲液（pH6.8）稀释至50 ml；
5.旋紧管盖颠倒混匀数次；
6.3 000 g离心力离心至少15 min；
7.将上清液转移至装有消毒剂的废液容器；
8.向沉淀物加入1 ml无菌生理盐水；旋紧管盖混合均匀，作为接种培养物；
9.将培养物接种至适当培养基上进行培养；
10.制作涂片，固定后抗酸染色镜检。
（三） 5%草酸法
此法最初用于处理来自囊性纤维化（CF）患者的呼吸道标本，由于CF患者痰液中常常分离出铜绿假单胞菌，此菌因能快速生长且不易被杀死而影响结核分枝杆菌的分离，此法优于NaOH法处理铜绿假单胞菌及其他污染菌的去污染效果，亦可以用于处理其他液体培养因铜绿假单胞菌导致的污染。具体操作步骤如下。
1.向标本中加入等量体积的新鲜5%草酸溶液，如标本体积超过10 ml，可转移血性部位的10 ml标本至50 ml螺口离心管中，再加入10 ml草酸溶液；
2.旋紧管盖涡旋震荡22 s；
3.室温静置30 min，期间偶尔摇晃几次；
4.用无菌生理盐水稀释至50 ml；
5.旋紧管盖上下颠倒混匀；
6.3 000 g离心力离心至少15 min；
7.将上清液转移至装有消毒剂的废液容器，向沉淀物中加入几滴酚红指示剂，以滴定测量方式逐滴加入4%的NaOH溶液，直至指示剂变成淡粉色；
8.加入1 ml无菌生理盐水，旋紧管盖混匀，作为培养物；
9.将培养物接种至适当培养基上进行培养；
10.制作涂片，固定后抗酸染色镜检。
（四） 4%硫酸法
其液化效果不如NaOH，易污染，4%硫酸多用于处理尿标本及其他体液经碱处理法后依旧发生污染的标本，具体操作步骤如下。
1.将所有标本以≥3 000 g离心力离心30 min；
2.去除上清至含消毒剂的废液容器，如使用多支离心管需将各管的沉淀合并至一管；
3.加入等体积的4%浓度的硫酸溶液至沉淀物中；
4.旋紧管盖涡旋震荡混匀，室温静置15 min；
5.向离心管加入至50 ml的无菌生理盐水；
6.旋紧管盖上下颠倒混匀，以≥3 000 g离心力离心15 min，弃掉上清液；
7.加入1滴酚红指示剂，以滴定测量方式逐滴加入4%的NaOH溶液，直至指示剂变成淡粉色；
8.加入1 ml生理盐水，旋紧管盖混匀，作为培养物；
9.将培养物接种至适当培养基上进行培养；
10.制作涂片，固定后抗酸染色镜检。
（五） 苯扎氯铵三钠磷酸盐法
苯扎氯铵是一种季铵盐，联合三钠磷酸盐后可以选择性破坏许多污染细菌而对结核分枝杆菌的损伤较小，此法适用于实验室无法计算标本暴露于去污染试剂中的时间时使用。苯扎氯铵对于结核分枝杆菌而言为抑菌剂，又兼具消化功效，离心后的沉淀在接种前必须经缓冲液中和，富含卵磷脂的培养基可以对其进行中和。该组试剂不能与BACTEC系统联合使用。具体操作步骤如下。
1.向50 ml离心管中加入不超过10 ml的标本，等体积加入苯扎氯铵三钠磷酸盐溶液消化；
2.旋紧管盖，将离心管倒置，放置于摇床上摇晃30 min，然后室温静置20 ～30 min；
3.以≥3 000 g离心力离心15 min，弃掉上清液；加入20 ml专门的缓冲溶液，旋紧管盖，涡旋震荡32 s以彻底悬浮沉淀（缓冲溶液的作用是灭活沉淀中微量的苯扎氯铵，否则会中和培养基中的磷脂而影响培养基的营养成分）；
4.再次离心15 min；
5.弃掉上清，加入1 ml无菌生理盐水重悬沉淀；
6.将培养物接种至适当培养基上进行培养；
7.制作涂片，固定后抗酸染色镜检。
（六） 1%氯化十六烷基吡啶法（CPC）
CPC也是一种季铵盐，可以用作标本的去污染，而其中的2%氯化钠可以起到液化的作用。CPC对于接种至琼脂基础培养基上的结核分枝杆菌而言是一种抑菌剂，由于在样本处理过程中没有进行中和步骤，因此只适用于接种鸡蛋为基础的培养基，如罗氏培养基，原理同苯扎氯铵相同。培养基中的卵磷脂可以中和CPC。此法适用于远距离运输标本至参考实验室检测，因为结核分枝杆菌在此溶液中8 d仍能保持活性。具体操作步骤如下。
1.将不超过10 ml的痰液加入至50 ml离心管中；(https://www.daowen.com)
2.向管中加入等体积的CPC—NaCl溶液，旋紧管盖，摇晃离心管直至样本液化；
3.用无菌生理盐水稀释至50 ml，旋紧管盖颠倒混匀数次；
4.以≥3 000 g离心力离心15 min，弃掉上清液；
5.加入1 ml无菌生理盐水重悬沉淀；
6.接种沉淀至培养基；
7.制作涂片，固定后抗酸染色镜检。
（七） 1%氯己定法
氯己定又名洗必泰，是一种广谱抗生素，具有相当强的广谱抑菌、杀菌作用，是一种较好的杀菌消毒药，对革兰阳性菌、阴性菌的抗菌作用，比新洁尔灭等消毒药强，即使在有血清、血液等存在时仍有效。氯己定对非结核分枝杆菌如胞内分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌、草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌等伤害作用大，对结核分枝杆菌伤害作用小。氯己定处理的标本不能接种BACTEC系统，适合于接种鸡蛋为基础的培养基。二硫苏糖醇（DTT）常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M盐酸胍、8M尿素或1% SDS）。
1.样品中加入等量的0.1%二硫苏糖醇，室温下涡旋振荡15 min；
2.加入三倍体积的1%葡萄糖酸氯己定，在室温下涡旋振荡15 min；
3.样品用磷酸盐缓冲液洗涤，3 000 g离心20 min；
4.弃上清，重悬于1 ml的PBS，混匀；
5.接种于罗氏培养基。
（八） 10%磷酸三钠方法
它是一种适用于新鲜标本的处理方法。本法对结核杆菌的损害比NaOH法小很多，但污染率较高；2 d内可杀死杂菌，而对结核杆菌7 d内不影响其阳性结果，故进行大量培养工作时可使用此方法。
1.取约5 ml痰液放到普通容器内，加等量10%磷酸三钠溶液，在振荡器上涡旋振摇混匀；
2.在37℃培养箱内，孵育24 h；
3.加无菌蒸馏水或无菌青霉素水溶液至50 ml，旋紧管盖颠倒混匀数次；
4.3 000 g离心30 min，弃掉上清液；
5.加入1 ml无菌蒸馏水重悬沉淀；
6.接种沉淀至培养基；
7.涂片备抗酸染色镜检。
（九） 0.1%新洁尔灭法
新洁尔灭别名为苯扎溴铵/溴化苄烷铵，水溶液呈弱碱性反应，振摇时产生多量泡沫。本品在水或乙醇中极易溶解，属消毒防腐药。它是阳离子表面活性剂，能破坏细胞膜，改变其通透性而起杀菌作用，具有杀菌和去垢效力，作用强而快，对金属无腐蚀作用，不污染衣服，性质稳定，易于保存；对革兰阴性杆菌及肠道病毒作用弱，对结核分枝杆菌及芽孢无效。新洁尔灭的常用浓度为0.1%～0.2%。
1.取1 ～2 ml痰液加2 ～3倍0.1%新洁尔灭；
2.在振荡器上涡旋振摇混匀，置37℃温箱10 min；
3.直接接种中性罗氏培养基2支，每支0.1 ml，置37℃温箱培养。
（十） SDS—NaOH法
1.将3 ml样品转移到50 ml塑料离心管中，并加入等量的SDS—NaOH溶液（1%NaOH+3% SDS）。
2.在振荡器上涡旋振荡混匀，室温放置30 min，期间不断摇匀；
3.加入含有0.006%溴甲酚紫作为pH指示剂的H3PO4中和样品。
4.4 000 g离心20 min，弃去上清液；
5.加40 ml蒸馏水混匀；
6.4 000 g离心20 min，弃去上清液；
7.加1 ml蒸馏水混匀；
8.接种液体或固体培养基；
9.涂片备抗酸染色镜检。
（十一） 0.1%二硫苏糖醇—2% NaOH
二硫苏糖醇是一种去黏剂，在空气中较NALC更稳定，但价格昂贵，具有打开二硫键的作用，是很有效的溶痰剂，与标本作用时间不可超过15 min。该方法在美国使用普遍。
1.试剂配制
取2 g NaOH加入80 ml灭菌蒸馏水中，完全溶解后补充蒸馏水至终体积100 ml，121℃30 min，高压灭菌。使用时加入0.1 g二硫苏糖醇。
2.操作步骤
（1） 将标本装于离心试管中，加入等量、常温的含0.1%二硫苏糖醇的2% NaOH，以Vortex搅拌器（或其他）剧烈振动，静置15 min。
（2） 加无菌0.067 mol/L PBS、pH6.8至离心管，直至离盖子1.2 cm处，关紧盖子，颠倒混匀离心管至少3次。
（3） 3 000 g离心15 min，离心完毕后，将上清液倒掉，保留沉淀物。
（4） 加1 ～2 ml PBS缓冲液至沉淀物，以手轻摇混合。
（5） 取沉淀物直接涂片及接种培养。
（范齐文 钱雪琴）
参考文献
1.Betty A.Forbes, Niaz Banaiee, Kathleen G.Beavis, et al.Laboratory detection and identification of Mycobacteria［EB/OL］.Approved Guideline.CLSI M48—A, Vol 28: N.17.
2.Leber AL.Clinical microbiology procedures handbook［M］.4th edition.Washington, DC :ASM Press.2016.
3.Jorgensen JH, Pfalle MA, et al.Manual of clinical microbiology［M］.11th edition.Washington, DC: ASM press.2015.
4.Caulfield AJ, Wengenack NL.Diagnosis of active tuberculosis disease: From microscopy to molecular techniques［J］.Journal of Clinical Tuberculosis and Other Mycobacterial Diseases.2016; 4(8): 33—43.
5.Ferroni A, Vu-Thien H, Lanotte P, et al.Value of the chlorhexidine decontamination method for recovery of nontuberculous mycobacteria from sputum samples of patients with cystic fibrosis［J］.Journal of Clinical Microbiology.2006; 44(6): 2237—2239.
6.Chadwick MV.分枝杆菌［M］.李国利，庄玉辉，译.北京：人民军医出版社，1985.
7.王金良，倪语星，徐英春，等.分枝杆菌病实验诊断规范［M］.北京：上海科学技术出版社，2006.
8.郭钧.结核病细菌学［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，1983.
9.孟昭赫，郭钧.结核病细菌学诊断法［M］.北京：北京书店出版社, 1951.
10.北京结核病研究所.结核病学［M］.北京：人民卫生出版社，1964.
11.蔡文城.实用临床微生物诊断学［M］.南京:东南大学出版社，1998.