NTM不同菌种药敏试验方法
随着NTM耐药菌株的逐渐增多，以及大多数非结核分枝杆菌对常用的抗结核药物呈高度耐药，根据分枝杆菌药敏结果选择治疗方案，对指导临床治疗具有重大意义。传统药敏试验（绝对浓度法和比例法）操作繁杂、费时较长且稳定性差，很难满足临床需要，而2003年美国临床实验室标准化委员会（CLSI）制定的《分枝杆菌药敏试验通过标准》（CLSI M24.A）采用标准化的液基微量稀释法进行药敏试验，具有操作相对简便、不需要特殊设备、准确性高及重复性好的特点，可以筛选有效的新型抗菌药物。所以，依据NTM种的不同，需根据实际情况选择药敏试验方法。
1.慢生长分枝杆菌药敏试验
（1） 鸟—胞内分枝杆菌（Mycobacterium avium complex，MAC）药敏试验： 鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌有许多相似之处，故合起来称之为鸟—胞内分枝杆菌复合群（MAC）。近年来发现HIV感染者和AIDS患者易感染MAC。由于MAC对目前常用的几种抗结核药不敏感或耐药，特别是对于异烟肼和吡嗪酰胺天然耐药，而对大环内酯类药物敏感，美国FDA批准将阿奇霉素和克拉霉素用于MAC病的治疗，但需要连用其他1 ～2种抗生素（乙胺丁醇和利福平）。美国第九版《临床微生物手册》中描述的微量肉汤稀释法与加拿大多伦多大学使用的MIC改良方法比较接近，目前此项技术的使用越来越广泛。CLSI推荐对胞内分枝杆菌进行包括克拉霉素、莫西沙星和利奈唑胺在内的药物敏感性试验，以克拉霉素作为治疗胞内分枝杆菌感染的关键药物，并且推荐了包含上述药物的临界浓度。
克拉霉素药敏试验浓度范围为2～64 μg/ml，当MIC≤4 μg/ml定义为敏感，8～16 μg/ml定义为中度敏感，≥32 μg/ml定义为耐药。此试验以鸟分枝杆菌作为质控菌株，浓度使用0.5、1和2 μg/ml。关于阿奇霉素的药敏试验，CLSI推荐使用BACTEC 12B培养基的试管肉汤稀释法，浓度范围使用16 ～512 μg/ml，或是选择32、128和512 μg/ml三个浓度，当MIC≤128 μg/ml定义为敏感，等于256 μg/ml为中度敏感，MIC≥512 μg/ml定为耐药。此试验以鸟分枝杆菌作为质控菌株，选择8、16和32 μg/ml三个浓度。CLSI建议仅做克拉霉素或阿奇霉素中的一种药敏试验即可，互相可预测另一种药物的敏感性。有研究报道，鸟—胞内分枝杆菌复合群对克拉霉素的耐药率为11.36%，利福平耐药率为95.45%，利福喷丁耐药率为29.55%，阿米卡星耐药率为43.18%。
（2） 堪萨斯分枝杆菌药敏试验： “中华医学会结核病学分会专家共识”（简称“专家共识”）推荐，对未经治疗的堪萨斯分枝杆菌病患者，仅需进行利福平药敏试验，若利福平耐药，即要使用微量肉汤稀释法进行多种抗结核药物敏感试验。目前推荐如下8种药物进行药敏试验：利福布汀、乙胺丁醇、异烟肼、链霉素、克拉霉素、阿米卡星、环丙沙星、磺胺甲
唑/甲氧嘧啶或新诺明，堪萨斯分枝杆菌（ATCC12478）或海分枝杆菌（ATCC927）用于堪萨斯分枝杆菌对利福平药敏试验的质控菌株。
（3） 海分枝杆菌药敏试验： 目前海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）病的治疗常使用利福平、利福布汀、乙胺丁醇、克拉霉素、磺胺类药物、多西环素、米诺环素等单一药物治疗或1 ～2种药物联用。由于海分枝杆菌对上述药物的MIC范围较窄，因此“专家共识”推荐海分枝杆菌分离株不需进行常规药敏试验，但治疗失败患者例外。研究人员曾采用肉汤微量稀释法药敏试验研究了利福平、阿米卡星、克拉霉素、莫西沙星、链霉素等5种药物间不同药物组合对海分枝杆菌的杀菌效果，发现利福平和阿米卡星药物组合杀菌效果最好，链霉素和克拉霉素药物组合最差。因此，推荐使用海分枝杆菌作为耐多药结核病的研究模型，用于药敏试验研究。
（4） 其他慢生长分枝杆菌： 对于土地/不产色分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌和猿分枝杆菌的药敏试验，参考堪萨斯分枝杆菌的操作流程；嗜血分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、溃疡分枝杆菌等，目前了解甚少，没有推荐的药敏试验方法；戈登分枝杆菌因为基本不致病，所以药敏试验需求甚少，因此还没有推荐的药敏试验方法。
2.快生长分枝杆菌药敏试验 CLSI推荐了对RGM（包括脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌和Fuerth分枝杆菌）进行包括阿米卡星、头孢西丁、克拉霉素、阿奇霉素、亚胺培南、莫西沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、多西环素、美罗培南、磺胺甲
唑和妥布霉素在内的药敏试验，并推荐了包含以上药物的临界浓度（包括敏感临界浓度、中度敏感临界浓度和耐药临界浓度），参见本书第191页“表12—3—0—2”。临床上快速生长分枝杆菌感染所致疾病中主要以龟、脓肿、偶发分枝杆菌为常见，我国制定的“专家共识”推荐常规药敏试验应包括阿米卡星、亚胺培南、多西环素、氟喹诺酮类药物、磺胺类、头孢西丁、克拉霉素、利奈唑胺和妥布霉素。采用微量肉汤稀释法进行几种常用药物敏感性试验，用二倍稀释法将药物从高浓度向低浓度稀释，在孔中加入一定浓度的菌悬液，设立不加药物对照孔和不加药物与菌液的空白对照孔，置30℃环境内孵育，3 ～5 d观察结果并与对照孔作对比，当对照孔生长菌量数为“+”以上时读取细菌不生长的最低浓度孔，此孔的药敏浓度即为MIC。
对于结果的报告，由于亚胺培南不稳定，龟、脓肿分枝杆菌需要长时间孵育，因此这2个菌种的药敏不报告亚胺培南结果，CLSI推荐妥布霉素仅用来做龟分枝杆菌药敏试验。对于其他快速生长分枝杆菌的药敏试验可参照龟、脓肿、偶发分枝杆菌的方法，若患者在规范治疗半年后，分枝杆菌培养仍为阳性则考虑需重新进行NTM的药敏试验。目前关于快速生长分枝杆菌药敏试验的质量控制，推荐使用外来分枝杆菌（M.peregrinum）（ATCC700686）作为质控菌株或金黄色葡萄球菌（ATCC29213）作为替代。
3.NTM对不同药物耐药率研究
（1） 慢生长分枝杆菌对常用药物耐药情况： 目前研究显示，大多数NTM对一线抗结核药物原发耐药，导致患者病程迁延多年，成为慢性排菌者或难治性患者。同时NTM的实验室分离率近年来也有上升趋势。庞慧等发现，对慢生长分枝杆菌，异烟肼是敏感性最低的药物（11.76%），只对Mycobacterium szulgai ，Mycobacterium celatum ，Mycobacterium duvalii和Mycobacterium elephantis敏感。利福平（38.24%）和乙胺丁醇（41.18%）有相似的敏感性。链霉素（79.41%）是一线抗结核药物中效果最好的，对绝大多数的试验菌株都有较好的活性。庞慧等研究还发现二线药物氧氟沙星（67.65%）、卡那霉素（76.47%）和妥布霉素（76.47%）具有强有力的抗SGM活性，环丙沙星（91.18%）、左氧氟沙星（91.18%）、阿米卡星（97.96%）和卷曲霉素（97.06%）具有极好的抗慢生长分枝杆菌活性，莫西沙星（100%）的抗菌活性最强。而慢生长分枝杆菌中，Mycobacterium simiae和Mycobacterium africanum对更大多数药物耐药。Mycobacterium szulgai和Mycobacterium duvalii对一线和二线抗结核药物都有较好的活性。该研究发现，二线抗结核药物是治疗慢生长分枝杆菌的良好药物，优于一线药物，可被广泛用于慢生长分枝杆菌病的治疗。
崔岩飞等发现，胞内分枝杆菌对莫西沙星和利奈唑胺敏感率不理想（63.2%）。鸟分枝杆菌对克拉霉素、利奈唑胺表现出了较高的敏感度，对莫西沙星存在较高的耐药比例。堪萨斯分枝杆菌对试验药物莫西沙星、克拉霉素和利奈唑胺均表现出良好的敏感性。盛青等发现，戈登分枝杆菌对利福平、链霉素、克拉霉素、阿米卡星、莫西沙星、左氧氟沙星、利福布汀、丙硫异烟胺敏感，戈登分枝杆菌对抗结核药物敏感性最高、耐药率最低；次要分枝杆菌、不产色分枝杆菌对抗结核药物敏感性相对较高、耐药率较低；鸟—胞内分枝杆菌对抗结核药物耐药性高、敏感性低。
SGM对一线药物基本耐药，其中鸟—胞内分枝杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、对氨基水杨酸异烟肼片、左氧氟沙星耐药率极高，对阿米卡星、丙硫异烟胺、莫西沙星耐药率较高，对克拉霉素和利福布汀较敏感。堪萨斯分枝杆菌对异烟肼、链霉素、对氨基水杨酸异烟肼片耐药率极高，对利福平、乙胺丁醇和其余二线药物较敏感，戈登分枝杆菌对抗结核药物敏感性最高。
（2） 快生长分枝杆菌对常用药物耐药情况研究： 对于快生长分枝杆菌国内也有一些研究报道。崔岩飞等发现，脓肿分枝杆菌对阿米卡星和利奈唑胺是敏感率较高的药物，对头孢西丁大部分为中度敏感，对于克拉霉素及喹诺酮类药物则耐药率较高。盛青等发现，龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟—脓肿分枝杆菌复合群、龟—偶发分枝杆菌复合群、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌对抗结核药物耐药性高，敏感性低；克拉霉素对龟分枝杆菌、龟—偶发分枝杆菌复合群、耻垢分枝杆菌等菌种敏感性较高；利福平、链霉素、异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星、莫西沙星、丙硫异烟胺对龟分枝杆菌、龟—偶发分枝杆菌复合群、耻垢分枝杆菌均有较高耐药性，且耐药性均在60.0%以上；非结核分枝杆菌对多数抗结核药耐药性高。陈升汶报道，偶发分枝杆菌对阿米卡星（100%）、环丙沙星和氧氟沙星（100%）、磺胺（100%）、头孢西丁（80%）、亚胺培南（100%）、甲红霉素（8096）和多西环素（50%）敏感；偶发分枝杆菌对环丙沙星和氧氟抄星等药物敏感，对异烟肼耐药。在对偶发分枝杆菌引起感染的治疗时，选择有效药物，拟定一个联合治疗方案是治愈的关键。
RGM对一线药物耐药率极高，对对氨基水杨酸异烟肼、莫西沙星、左氧氟沙、丙硫异烟胺和利福布汀耐药率较高，仅对克拉霉素、阿奇霉素较敏感。脓肿分枝杆菌对阿米卡星和利奈唑胺敏感率较高，偶发分枝杆菌对阿米卡星、环丙沙星和氧氟沙星、磺胺、头孢西丁、亚胺培南、甲红霉素和多西环素敏感。
总体而言，NTM对目前的一线、二线抗结核药多数耐药，对克拉霉素较敏感，其中慢生长群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群）较快生长群（Ⅳ群）对各结核药敏感性相对较高。二线抗结核药物是治疗慢生长分枝杆菌的良好药物，优于一线药物，可广泛用于慢生长分枝杆菌病的治疗。以往在缺乏药敏结果前提下，常采用以克拉霉素为核心的抗NTM方案，而利奈唑胺也是目前发现不在指南推荐中的可用于NTM感染治疗的较佳药物。
4.开展NTM药敏试验需要关注的问题 非结核分枝杆菌的药敏试验与结核分枝杆菌存在很大的不同。NTM对多种抗结核药物天然耐药，且诊断困难、患者预后较差，美国胸科协会和美国感染病协会推荐在NTM病治疗前进行药敏试验，从而指导临床用药。然而，虽然美国CLSI对于一些NTM有推荐的药敏试验方法和药物临界浓度，比如CLSI建议对鸟—胞内分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、RGM使用微孔稀释法液体药敏试验。但即便是较被认可的药敏试验，也仍有待更充分地临床评价。但更多的药物是没有针对特定的菌种设定特定的药物临界浓度的。因此，当开展没有推荐临界浓度药物的药敏试验时，常规做法是慢生长分枝杆菌多参照结核分枝杆菌选取临界药物浓度，而快生长分枝杆菌多参照普通细菌选取临界药物浓度。然而，不同种的分枝杆菌的耐药临界浓度可能存在明显差异，因此需要更多的临床和基础研究以建立针对不同菌种的药敏试验方法。
从目前已获得的数据来看，NTM感染的治疗效果主要取决于菌种，如堪萨斯、海、苏尔加、蟾蜍和溃疡分枝杆菌的疗效较好，而MAC与脓肿、龟分枝杆菌病的临床治疗非常困难，表明种属对药物的敏感性至关重要。随着研究的深入，发现种属内对很多药物的敏感性存在分化，由此提出了对药敏试验的临床需求。在临床开展NTM药敏试验用于指导治疗药物的选择时，至少要考虑以下原则。
（1） 应在菌种鉴定的基础上开展NTM的药敏试验。不同NTM菌种耐药临界点有较大差别，以克拉霉素为例，MAC的耐药临界点为32 μg/ml，而快生长分枝杆菌的耐药临界点则为8 μg/ml，未行菌种鉴定的药敏试验结果有可能误导治疗方案的制订。
（2） 药敏试验前应先评估NTM菌株与疾病的相关性。不建议常规对分离到的与疾病相关性较低的NTM进行药敏试验。如痰标本分离出的戈登分枝杆菌、土分枝杆菌往往不致病，进行药敏试验会导致浪费医疗资源。
（3） 多数NTM 对药物的体外敏感性与临床疗效间尚未建立起充分的关联，现有数据仅支持MAC的疗效与细菌在体外对大环内酯类药物的敏感性有关联，其他药物的体外药敏试验结果与临床疗效的关系尚未发现明确的联系，或是目前的数据尚不足以得出明确的结论。
（4） 在缺乏肯定的体外药敏试验方法前，建议体外药物敏感试验以梯度浓度的方法检测菌株的耐药浓度，结合患者相应药物在体内的血药浓度可能更有利于判定其体内抗菌效果。(https://www.daowen.com)
（5） 对于快生长分枝杆菌（RGM）推荐进行药敏试验，推荐使用微孔板稀释法；RGM的体外DST结果与临床疗效可能相关；重点关注RGM治疗的待选药物，包括大环内酯类、氨基糖苷类、环丙沙星或莫西沙星、亚胺培南—西司他丁、多西环素、替加环素、头孢西丁、磺胺、利奈唑胺等。
（6） 对于慢生长分枝杆菌（SGM）中的MAC，推荐培养管稀释法，重点关注其对大环内酯类药物的敏感性，要考虑利福霉素类在体内对其的降解作用；对于堪萨斯分枝杆菌，推荐培养管稀释法，重点关注其对利福平的敏感性，如果利福平耐药，可以参照结核分枝杆菌或MAC的关键浓度进行其他药敏试验；对于其他SGM，目前尚未有明确的推荐方法。
（7） 海分枝杆菌生长速度介于RGM和SGM之间，没有必要常规开展药敏试验，因为以下药物单独使用或联合使用有很好的疗效：米诺环素、利福平、磺胺、克拉霉素。通常情况下海分枝杆菌临床分离株对上述药物的体外试验都显示为敏感，只有经验治疗失败的病例才考虑进行药敏试验。
总之，NTM的表型药敏试验方法目前还都不太成熟，仍有待不断完善，并在临床充分地评价的基础上不断调整。只有建立在大量数据基础上的非结核分枝杆菌的药敏试验，其结果才更有指导意义。
（黄海荣）
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