γ干扰素释放试验（IGRA）
（一） 概述
MTB感染后，患者的外周血中会产生特异性活化的效应T细胞，经MTB特异抗原[ESAT—6、CFP—10和（或）TB7.7]刺激后，可分泌γ 干扰素（ IFN—γ），通过体外检测γ 干扰素分泌水平或分泌γ干扰素的T细胞，来判断机体是否处于MTB感染状态。这些特异性抗原是在结核分枝杆菌基因组的差异区域（RD1）中编码的抗原，包括早期分泌的抗原靶标6（ESAT—6）、TB7.7和培养滤液蛋白10（CFP—10）等。这些蛋白质不存在于牛分枝杆菌BCG的所有菌株和绝大多数非结核分枝杆菌中（除了堪萨斯分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和海分枝杆菌之外），但存在于结核分枝杆菌的分离株中。相比之下，TST使用混合的非特异性PPD，一种含有200多种抗原的结核分枝杆菌培养滤液，特异性远低于IGRAs。
目前，IGRAs商品化试剂盒主要以T—SPOT.TB试剂盒和QuantiFER ON-TBGold In Tube（QFT）试剂盒为代表，前者的原理为采用酶联免疫斑点技术，以MTB特异性抗原ESAT—6和CFP—10刺激外周血分离的单个核细胞，检测分泌IFN—γ的T细胞数量；后者的原理为采用酶联免疫吸附试验，以ESAT—6、CFP—10、TB7.7抗原刺激全血中致敏T细胞，测定全血中特异性T细胞所释放的IFN—γ水平。
（二） IGRA优点
国内外研究表明，IGRA显示出很多超越TST的优点。
1.由于使用了来自RD1区的结核分枝杆菌特异性抗原，使得IGRA不受卡介苗接种和大多数环境分枝杆菌的影响。
2.IGRA试验设置了阳性对照孔和阴性对照孔，以利于评价受试者的基础免疫状态（阳性对照孔无反应）和污染（阴性对照孔产生大量γ干扰素）所致的不准确结果，从而提高了方法的可靠性。
3.与TST不同的是，IGRA试验过程可在体外完成，结果判定无须回访且不受人为因素的影响；同时IGRA所需时间较TST短，结果获得较快。
4.IGRA由于有较高的阴性预测值（NPV），对排除非结核分枝杆菌意义较大。
（三） IGRA缺点
1.IGRAs同PPD皮肤试验阳性结果一样，IGRAs阳性结果仅能提示结核感染的存在，不能有效区分潜伏结核感染（LTBI）和活动性结核病（ATB），不能准确预测LTBI发生ATB的风险。
2.ESAT—6和CFP—10主要存在于MTB复合群，而在卡介苗和大多数NTM中缺失，因此IGRAs的特异度较好。但ESAT—6和CFP—10也存在于少数几种NTM中，如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、转黄分枝杆菌和胃分枝杆菌，故IGRAs阳性不能排除上述几种NTM感染的可能。
3.由于ELISPOT技术是从单细胞水平进行检测，可及时捕获细胞周围分泌的细胞因子，故敏感度更高。但在实际使用中发现，IGRAs在不同地区、不同人群中的特异度和敏感度均存在较大差异，在某些人群中并未显示其敏感度和特异度优于PPD试验。① IGRAs在HIV感染患者中的诊断价值明显降低。② 在儿童患者中，IGRAs敏感性和特异性较成人低，其敏感性与TST无明显差异，但特异性较TST有明显优势，且注射BCG与否对其特异性影响较小。③ IGRAs敏感性和特异性在TB高发区有一定程度下降，对敏感性影响更大，考虑与营养状况、HIV感染等有关。
4.IGRAs对试验技术和试验条件要求较高，价格昂贵，样本检测时限短，难以实现高通量检测，因而限制了在中低收入国家的推广应用。
5.不同IGRAs产品使用的抗原、检测试剂、检测参数和界值设定等可能存在差异，对最终检测结果及其判读有一定影响。
6.近些年的研究发现，在美国健康的医务工作者中开展系列IRGAs检测，出现假阳性和假阴性结果，而且这种现象比结核皮肤试验还要常见。此外，IGRAs价格昂贵，实验室工作量更大。
7.欧洲克罗恩病和结肠炎组织（ECCO）推荐应用TST进行TB患病风险的评估，而IGRAs用于BCG注射人群。在没有使用免疫抑制剂的患者中，如注射过BCG，则推荐使用IGRAs进行筛查。
（四） 临床应用
1.克罗恩病（CD）与肠结核（ITB）的鉴别诊断。
2.呼吸系统疾病与结核病的鉴别诊断。
3.胸片阴影待查患者的结核病排筛。
4.抗炎治疗效果不佳患者结核病排筛。
5.抑制剂治疗前后的结核病筛查。
6.大量激素治疗前后的结核病筛查。
7.自身免疫性疾病与结核病的鉴别诊断。
（五） QFT与T—SPOT方法区别
1.所采用的刺激抗原不同
（1） QFT：ESAT—6，CFP—10，TB7.7。
（2） T—SPOT：ESAT—6，CFP—10 。
2.检测IFN—γ方法不同
（1） QFT：酶联免疫吸附试验（ELISA）。
（2） T—SPOT：酶联免疫斑点试验（ELISPOT）。
3.结果报告指标不同
（1） QFT：IFN—γ浓度（单位：U/ml，1 U/ml=50 pg/ml），三种抗原混合在一起检测后报告结果。
（2） T—SPOT：斑点形成单位，也就是“点数”，抗原A和抗原B分别报告结果。(https://www.daowen.com)
4.诊断活动性结核（血液标本）敏感性和特异性不同
（1） QFT的敏感性为80% （95% CI：75%～84%），特异性为79%（95% CI：75%～82%）。
（2） T—SPOT的敏感性81% （95% CI：78%～84%），特异性为59% （95% CI：56%～62%）。
（3） 部分研究结果认为，重度免疫抑制患者（如HIV感染患者CD4＜200 cells/μl），QFT的敏感性低于T—SPOT，但大多数结果未发现明显差异。
5.非血液标本检测方面
（1） QFT用于非血液标本检测，如肺泡灌洗液、脑脊液、胸水、腹水等，敏感性为48%（95%CI：39%～58%），特异性为82% （95% CI：70%～91%），QFT用于非血液标本检测，出现无法判定结果的比例较高，平均23.1%。
（2） T—SPOT用于非血液标本检测，敏感性为88% （95% CI：82%～92%），特异性为82%（95% CI：7886%），诊断效果高于QFT，也高于血液标本。
6.T—SPOT的点数和QFT的数值代表意义不完全相同
（1） QFT数值：代表受结核抗原刺激T细胞释放IFN— γ的量。
（2） T—SPOT点数代表受结核抗原刺激能够释放IFN—γ的T细胞数量。
（3） 两者之前具有显著相关性，r值显示中度相关，r=0.477 7 （95% CI～ 0.374 1～0.569 5）。
（4） T—SPOT与QFT结果的一致性较高，符合率＞85% 。
7.无法判定结果
QFT出现无法判定结果的情况约为7%。
T—SPOT出现无法判定结果的情况约为3.4%。
（六） T—SPOT
1.概述 酶联免疫斑点试验（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT），其商品化的试剂盒为T—SPOT.TB（T—SPOT），试验需要分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），然后与RD1区抗原同孵育，使用酶联免疫斑点法检查分泌干扰素的特异效应T细胞数量。
2.结果判断 一般可按如下表7—2—2—1判断结果，不同试剂盒可能略有差异。空白对照孔点数=N，检测孔点数=T，阳性质控孔点数=P。T—SPOT抗原A+抗原B ＞100，可认为是强阳性结果，特异性＞90%（10个患者里9个以上为活动性结核病）。
表7—2—2—1 T—SPOT 结果判断标准
（七） QFT
1.概述 酶联免疫吸附试验，其商品化试剂盒为QuantiFERON—TB GOLD（QFT—G）和QuantiFERON—TB GOLD In Tube（QFT—GIT），其主要优势为不用分离PBMC，直接将肝素化的全血与RD1区抗原共同孵育，使用ELISA的方法检测弥散至血浆中IFN— γ的水平。
2005年，QFT—G成为FDA批准的第二个IGRA，用于诊断结核分枝杆菌感染。它评估了受试患者对ESAT—6和CFP—10的免疫反应性。对于QFT—G，将单独的新鲜全血等分试样与对照样和两种单独的肽（ESAT—6和CFP—10）混合物一起孵育。计算为抗原刺激的血浆中IFN— γ浓度减去阴性对照的血浆中的IFN —γ浓度。FDA批准的规定包括解释标准，见表7—2—2—2。
表7—2—2—2 QFT—G 解释标准
QFN—GIT是将肝素化的外周血分别置于阴性对照管，ESAT—6、CFP—10和TB7.7混合抗原管，以及阳性对照三个管中，37℃共孵过夜，抗原管与阴性对照管中IFN—γ水平之差＞0.35 U/ml即为阳性。具体见表7—2—2—3，如阳性对照管IFN—γ＜0.5 U/ml且混合抗原管无反应，则结果视为无法确定。此情况出现的原因可能是血样中淋巴细胞不足，或因送检延迟、样本保存不当致淋巴细胞活性降低，抑或患者淋巴细胞不能产生IFN—γ。
表7—2—2—3 QFT—GIT 解释标准
2.报告结果解读
（1） 检测结果阳性：其临床意义是指样本中存在针对MTB特异的效应T细胞，提示结核感染可能。同时，需要结合临床排除堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、浅黄分枝杆菌和胃分枝杆菌等非结核分枝杆菌感染可能。QFT结果＞4 U/ml，可作为强阳性结果，特异性＞90%。
（2） 检测结果阴性：是指样本中可能不存在针对MTB特异的效应T细胞，提示近期无结核感染可能，但需要结合临床，除外重症结核病、免疫缺陷者、接受免疫抑制剂或激素治疗患者所致假阴性。
（3） 检测结果为灰区：排除实验室技术原因外，则考虑是否是患者T细胞效能降低所致。
（4） 检测结果不确定：需要结合临床判断是否存在近期结核感染可能，并考虑患者是否有细胞免疫功能下降或T细胞数量减少。临床上发现，患者年龄越小，其检测所得不确定结果有增高趋势，但仍需要开展大样本量研究加以证明。
3.QFT出现无法确定结果的处理 QFT出现无法判定结果的情况约为7%，绝大多数是因阳性对照反应过低。高危因素包括：女性，年龄＞60岁或者＜5岁，淋巴细胞减少症，低蛋白血症，抽血操作不当，等等。如果出现无法判定结果的情况，需要重复进行检测，重复检测确定率58%。