在分枝杆菌鉴定中的应用
众多数据证明，MALDI Biotyper能够准确鉴定来自不同样本的微生物，包括革兰阴性菌如肠杆菌、非发酵阴性杆菌、链球菌、棒状杆菌、葡萄球菌、各类苛养菌和厌氧菌，以及真菌如念珠菌、隐球菌和曲霉菌等。MALDI Biotyper在分枝杆菌的鉴定上也具有巨大优势。
（一） 分枝杆菌鉴定现状
分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）和非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacteria，NTM）。后者是指除MTBC和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌，在环境中广泛存在。迄今为止发现的NTM已超过190种（http://www.bacterio.net/mycobacterium.html）。近年来，NTM的感染率和致病率显著升高，可以造成宿主肺部、关节、皮肤和软组织感染，并造成全身扩散。不同种属的NTM，其致病性、临床特征和治疗手段差别较大，因此其准确鉴定具有重要意义。
而实验室对分枝杆菌鉴定手段的缺乏，是制约分枝杆菌感染快速诊断治疗的瓶颈。分枝杆菌鉴定困难主要原因在于分枝杆菌生长缓慢以及对营养需求高。传统的生化反应鉴定操作复杂且费时，鉴定重复性差。核酸探针的方法则仅针对几种分枝杆菌，不具备通用性，分子测序的方法虽准确性高，但成本高，目前不适用于实验室常规检测。
（二） MALDI Biotyper对分枝杆菌的鉴定
1.MALDI Biotyper鉴定分枝杆菌样品制备方法 分枝杆菌因其细胞壁成分比较复杂，且具有一定的生物危害，因此不同于大多数微生物可以采用靶板上直接涂抹的样品的制备方法，建议实验室采用提取法进行样品制备，以此灭活分枝杆菌并获得更高质量的蛋白图谱。MALDI Biotyper针对分枝杆菌优化了一种安全、简单的基于硅珠研磨提取的分枝杆菌样品处理方法，大大提高了分枝杆菌的鉴定效率。其具体步骤如图9—1—2—1所示。
图9—1—2—1 MALDI Biotyper鉴定分枝杆菌的样品处理流程
（1） 灭活：转移分枝杆菌样本至离心管中，加入300 μl去离子水配成菌悬液，95℃加热30 min灭活。未知的分枝杆菌样本应视为潜在的MTBC成员，因此必须对分枝杆菌样本进行灭活。
（2） 研磨：在灭活后的菌悬液中加入900 μl无水乙醇，充分混匀；离心，弃去上清，室温下晾干沉淀（几分钟即可）加入少量氧化锆/二氧化硅微珠和10 ～50 μl乙腈，涡旋振荡1 min，研磨破坏细胞壁。
（3） 提取：加入70%甲酸水溶液（体积与加入的乙腈体积相同），涡旋振荡5 s，离心取1 μl上清液点至MALDI靶板上，室温晾干后，立即覆盖1 μl基质溶液。室温晾干后进行鉴定。
2.MALDI Biotyper鉴定分枝杆菌的数据库和软件
（1） MALDI Biotyper分枝杆菌数据库：Biotyper有专门针对分枝杆菌鉴定的Mycobacteria Library 5.0数据库，现数据库中包含了912个标准图谱，可鉴定包括MTBC及NTM共164种不同分枝杆菌。其建库流程科学严谨，建库菌种来源广泛，包括438株标准菌株，以及474株来自10个不同国家不同临床实验室的临床菌株，建库菌株培养分别采用固体和液体培养基，使建库数据更具代表性。
（2） MALDI Biotyper鉴定分枝杆菌的专用软件模块：除专门的数据库以外，MALDI Biotyper还专门设计配备用于鉴定分枝杆菌的软件模块（Mycobacteria Software Module），该模块基于大量研究数据，对分枝杆菌整个软件鉴定流程进行了优化，包括以下两点。① 针对分枝杆菌蛋白指纹图谱特征，优化了图谱采集标准。② 降低了结果分类阈值：以分值＞1.8定义为高置信度结果（种水平），1.6＜分值＜1.8为低置信度结果（属水平）。对图谱采集和结果判定的调整，使得MALDI Biotyper对分枝杆菌的鉴定在保证结果准确性的同时提高了灵敏度。
（3） MALDI Biotyper分枝杆菌分型模块：鸟分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex，MAC）是常见的致病性非结核分枝杆菌，群内包括鸟分枝杆菌（M.avium）、胞内分枝杆菌（M.intracellulare）和嵌合分枝杆菌（M.chimaera）等，复合群内的不同种分枝杆菌其致病性不同。美国ATS和IDSA 数据表明，胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌更容易引起肺部感染，而嵌合分枝杆菌则多存在于水系统中，可能通过医院heater-cooler系统感染引起心脏外科术后感染。因此，准确的种水平鉴定MAC，有利于进行有效的感染控制和治疗。
通常情况下MALDI TOF MS系统仅能准确区分鸟分枝杆菌，而群内的胞内分枝杆菌和嵌合分枝杆菌因图谱极其相近无法准确区分。因此，MALDI Biotyper在常规鉴定的基础之上，增加了区分胞内分枝杆菌和嵌合分枝杆菌的分型模块（Subtyping Module），在结果鉴定为该复合体且分值＞1.8时，系统自动计算样品蛋白图谱中4个特征峰的比值，从而自动区分两种近缘菌。其鉴定结果如图9—1—2—2所示。
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图9—1—2—2 MALDI Biotyper鉴定胞内/嵌合分枝杆菌的自动分型流程
（三） 影响MALDI Biotyper分枝杆菌鉴定结果的因素
1.培养条件
（1） 培养基：MALDI Biotyper可以准确鉴定固体培养基（如Löwenstein-Jensen）上培养的分枝杆菌。分枝杆菌的液体培养由于其报阳时间短于固体培养，慢慢成为分枝杆菌分离培养的趋势。研究结果表明，选用固体培养基或液体培养基（如MGIT）对MALDI Biotyper的鉴定准确性无明显差别。某些情况下，两者的鉴定结果差异可能来源于液体培养基报阳时过少的菌量或培养基残留成分的干扰。
（2） 培养时间：分枝杆菌根据不同类型，多数快生长分枝杆菌培养<7 d即可得到肉眼可见的用于鉴定的菌落，而慢生长分枝杆菌则需要培养更长时间。研究表明，某些分枝杆菌培养时间过长（>12 d）时，容易对培养基产生贴附，提取后残留培养基会降低图谱质量，最终导致低分值鉴定结果。
2.样品前处理方法 由于分枝杆菌的特殊性，分枝杆菌样品前处理方法应该包含灭活和蛋白提取两个关键步骤。除MALDI Biotyper提供的标准分枝杆菌样品灭活提取方法以外，实验室可以根据自己的需求对方法进行改进，已报道的改进方法包括研磨超声震荡、专利的自适应聚焦声波技术、冻融与组织研磨等。实验室需对本实验室的灭活提取方法进行验证后方可使用。
3.数据库 数据库的建库方法和数据库大小对鉴定结果具有重要影响。数据库升级可以提高MALDI Biotyper的鉴定准确率。MALDI Biotyper采用科学的无监督的基于菌株水平的建库方法，在保证准确率的同时也有利于数据库的更新，且支持用户自建数据库。
（四） MALDI Biotyper在分枝杆菌鉴定领域的应用限制
MALDI Biotyper能够准确鉴定大多数的分枝杆菌，但对于某些近缘菌，可能会出现不能鉴定到种/亚种或无法区分的情况。对于这些菌种，系统会在鉴定结果中给出提示，同时临床检验人员也应该谨记这些局限性，依据实际情况选择其他辅助鉴定方法，以保证报告的准确性。某些不易区分的近缘菌通过数据库升级或增加软件功能（如分型模块）可以进一步提高鉴定准确率。
（祝 坤）
参考文献
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