用于非结核分枝杆菌菌种分子鉴定的技术

1.PCR　PCR可直接应用于临床标本，并且可当天报告结果，是非结核分枝杆菌菌种分子鉴定的重要工具。试剂盒LightCycler Mycobacterium Detection Kit （Roche Products Ltd，Randburg，South Africa）以16S rRNA为目的基因，可应用呼吸道标本在90 min内准确鉴定出结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌，并可实现高通量检测。

2.线性探针技术（LPA）　代表性产品有以ITS为目的基因的Inno-LiPA Mycobacteria试剂盒（Innogenetics NV，Ghent，Belgium）和以23S rDNA为目的基因的Genotype Mycobacterium CM和AS试剂盒（Hain Lifescience GmbH，Nehren，Germany）。Inno-LiPA试剂盒可以鉴定结核分枝杆菌复合群及15种NTM，Genotype Mycobacterium CM试剂盒可以鉴定结核分枝杆菌复合群及24种NTM，Genotype Mycobacterium AS试剂盒可以额外鉴定19种NTM。Inno-LiPA试剂盒直接从呼吸道标本中进行菌种鉴定的灵敏度和特异度分别为79.5%和84.6%。GenoType CM/AS试剂盒与16S rRNA基因测序的一致率高达96%。LPA的优点：简化操作，检测时间短；缺点：鉴定菌种数量有限，价格昂贵。

3.DNA测序　随着分子生物学技术的发展，DNA测序技术具有快速、准确、相对不昂贵等优点而成为分枝杆菌菌种鉴定的“金标准”。最常用的基因为16S rRNA，其次为rpoB、gyrB、hsp65、recA、sodA、dnaJ或ITS。由于单一DNA序列比对鉴别力不够，一些亲缘关系相近的分枝杆菌无法被准确鉴别，而且一些新菌种或亚种也不能被鉴定出；另外，由于没有严格的审校程序，公开数据库均存在信息不全、碱基错误、命名错误等情况，可能会导致鉴定结果错误，因此联合应用多个DNA序列可提高分枝杆菌菌种鉴定的准确性。

“非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识”中应用同源序列比较进行菌种鉴定的建议：① 16S rRNA鉴别能力虽然相对较低，但由于目前其相关数据库最为完整，因此推荐常规使用。② ITS、hsp65和rpoB基因鉴别能力相对较高，建议至少选择其中之一与16S rRNA平行使用，以提高菌种鉴定的分辨能力。③ 在序列比较过程中对于种内序列差异较大的情况，应增加分子标识的检测数量，以期提高分辨率、发现新的种或亚种。