其他类型的表型药敏试验方法

1.快速诊断噬菌体法（FAST Plaque）　噬菌体是一种细菌病毒，分枝杆菌噬菌体能在活的分枝杆菌细胞内生长，通过噬菌体裂解试验可快速地鉴定活的分枝杆菌的存在。FAST Plaque试剂盒即以噬菌体技术为基础。分枝杆菌噬菌体可感染相应的活的分枝杆菌，若临床标本中含有相应的分枝杆菌，噬菌体可侵入菌体内进行大量繁殖，最终裂解菌体，释放出噬菌体感染指示细胞，并使指示细胞裂解，在琼脂板上出现噬菌斑。若临床标本中无相应的分枝杆菌，噬菌体将被加入的噬菌体杀灭剂杀死，指示细胞未受感染和裂解，在琼脂板上均匀生长。因此，根据噬菌斑的有无，可判断临床标本中是否存在相应活的分枝杆菌。其优点如下。① 快速：样本准备后24 h内出结果；② 敏感性高：敏感性可达100 ～300条菌/ml；③ 只检测活的结核分枝杆菌，减少了假阳性的可能性；④ 可检测耐药结核分枝杆菌；⑤ 安全：无须培养病原菌；⑥ 不需特殊的仪器设备。活的结核分枝杆菌可保护菌体内的噬菌体免受噬菌体杀灭剂作用。先将结核分枝杆菌与噬菌体共同孵育，使噬菌体侵入结核分枝杆菌内，再用抗结核药物处理结核分枝杆菌。若结核分枝杆菌耐药，则细菌能存活；随后加入噬菌体杀灭剂，位于菌体内部的噬菌体不被杀死；培养后，若有耐药结核分枝杆菌存在时会出现噬菌斑。

FAST Plaque可以检测不少于100条菌/ml的菌量，其敏感性可与聚合酶链氏反应（PCR）媲美，而且与培养法符合率高，快杀菌药物如利福平、链霉素、喹诺酮类2 d内可得到药敏结果，与培养符合率超过95%；慢杀菌药物异烟肼、乙胺丁醇需要增加一个预孵育过程使药物的杀菌效果能充分体现，所需时间为3 ～4 d，与培养符合率达90%左右。由于噬菌体的裂解作用，试验过程中能将结核分枝杆菌杀死，对试验操作人员有保护作用，而且不需特殊仪器，成本低廉，易于向低收入国家的实验室推广。虽然此项噬菌体技术在上市之初获得了高度的关注，但随着应用数据的增多，对此项技术评价可能更为客观和准确。于霞等采用Meta分析的方法评价噬菌体生物扩增法检测临床标本中结核分枝杆菌的准确性：综合分析所有数据，合并特异性为96%（96%～97%）；合并敏感度为69%（67%～72%）；合并诊断比数比为52.30（25.18 ～108.65）；SROC曲线下面积为0.93。对纳入的研究分析证实，噬菌体检测法检测临床标本中的结核分枝杆菌的敏感性偏低，但特异性相对比较好。然而在实际的检测过程中，噬菌体生物扩增法操作过于烦琐，尤其是在近几年新兴的分子生物学的技术使用越来越广泛的情况下，本方法逐渐被市场淘汰。

2.显微镜直接观察下的药敏测定法（microscopic-observation drug-susceptibility assay，MODS）　20世纪90年代末，在秘鲁进行的一次通过显色反应发现结核分枝杆菌的试验中，发现在显色发生之前就能够通过显微镜观察到结核分枝杆菌索状形态的菌落，由此开发出了MODS技术。MODS的工作原理有三点：① 结核分枝杆菌在液体培养基中的生长速度快于在固体培养基中的生长速度；② 细菌在液体培养基中生长时形成的特征性索状形态可以在细菌生长的早期阶段通过显微镜观察到；③ 在加入药物的情况下，可以在观察细菌生长的同时了解细菌的药敏情况。MODS技术就是对培养板7H9培养基中生长的结核分枝杆菌在生长的过程中形成的特征性索状形态通过倒置显微镜进行观察，通过设定加药的样孔和不加药的对照孔，可以同时分析细菌对异烟肼和利福平的药物敏感性。MODS技术能够在短时间内从痰标本中培养出结核分枝杆菌并且同时进行药敏分析的优点，使其具有非常高的应用价值。(https://www.daowen.com)

对应用MODS进行利福平和异烟肼的直接药敏试验的总结分析显示，针对利福平耐药MODS的敏感性和特异性均为96%，针对异烟肼耐药MODS的敏感性和特异性分别为92%和96%。MODS获得培养结果的中位时间是7 d，明显短于MBBact（BacTAlert）的13 d和罗氏培养的26 d；而当培养阳性的菌株再进行药敏分析时，MBBact（BacTAlert）还需要9 d，罗氏培养还需要42 d，但MODS不需要更多时间，培养的同时就进行了药敏分析。MODS培养的所有阳性结果都在21 d内出现，其中98%的标本在2周内出现阳性结果。应用MODS测定多耐药所需的材料和运作费远远低于快速培养和罗氏培养技术所需花费。MODS方法简单，操作程序易于掌握，即使是未进行过此试验的技术人员来说，只需简单培训就能操作。然而由于MODS涉及活菌的液体培养，对生物安全有较高的要求，并且操作过程中的污染问题也不容忽视。

3.比色法药敏试验 常用的比色法药敏试验根据显色所使用的试剂不同分为：硝酸盐还原试验法（nitrate reductase assay，NRA）、MTT指示管法[3—（4，5—dimethylthiazol—2—yl）—2，5—diphenyl tetrazolium bromide tube method，MTT]、微孔板Alamar Blue法（Microplate Alamar Blue assay，MABA）。比色法药敏试验无须昂贵的设备、经济、快速、操作简便，并且由于可以设定药物梯度，因此常用于测定细菌对药物的最低抑菌浓度（minimal inhibition concentration，MIC）。对已经报道研究的综合分析显示，比色法药敏试验对异烟肼和利福平的耐药诊断有较高的敏感性和特异性，如NRA法诊断利福平耐药的敏感性和特异性分别为99%和100%，诊断异烟肼耐药的敏感性和特异性分别为94%和100%，表明显色法作为一种直接药敏试验方法（可用于临床标本的直接检测）有较高的实用价值。

然而，由于缺乏公认的标准化操作程序（standard operating procedure，SOP），尤其是缺少接种菌量和结果判读的统一标准，因此影响了不同实验室数据的可比性，所有目前比色法药敏试验主要用于科学研究。Raut等研究通过对1个麦氏浓度的菌液采用3种不同比例稀释接种到MTT指示管中进行药敏试验，发现在接种量为107 CFU/ml时肉眼可见颜色变化最为明显，因此建议将该浓度作为标化的接种量应用到以后的研究中。另外，比色法药敏试验一般通过肉眼或通过分光光度计测定相对光密度单位（relative optical density unit，RODU）来读取结果，已知RODU要比肉眼判断准确，因此有人建议比色法药敏试验结果采用RODU读取以减少肉眼判读的误差，然而如此一来增加了操作的复杂程度和对仪器设备的依赖。NRA法的缺点就是不能检测硝酸盐还原酶阴性的菌株，无法在牛分枝杆菌上应用。MABA测定MIC存在重复性差的问题，Leonard等同一份痰标本（n=330）进行MABA法测定菌株MIC，结果MIC相差一个2倍数量级的比例如下，异烟肼：1.21%；利福平：1.51%；环丙沙星：3.03%；卷曲霉素：2.42%；链霉素：5.45%；乙胺丁醇：8.48%。MIC漂移与被测定的药物相关，INH与RFP相对较稳定，而SM和EMB相对较不稳定。研究者推荐应对菌株MIC在耐药临界值附近的结果慎重读取，必要时应重复MIC的测定。