用于非结核分枝杆菌菌种分子鉴定的DNA序列

1.16S rRNA　16S rRNA不仅可用于鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，还可鉴别一些应用传统生化方法鉴别困难的菌种，因此应用16S rRNA可发现一些新菌种。但由于16S rRNA序列的高度保守性，一些具有临床意义的分枝杆菌16S rRNA序列完全一致，因此单独应用16S rRNA测序方法无法鉴别，如堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌，塞内加尔分枝杆菌与鼻疽分枝杆菌，玛尔摩分枝杆菌与苏尔加分枝杆菌，脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌，东海分枝杆菌和壁分枝杆菌，海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌，败血症分枝杆菌和罕见分枝杆菌，鸟分枝杆菌复合群、偶发分枝杆菌复合群和结核分枝杆菌复合群成员等。

2.ITS　ITS序列的种间变异度大于16S rRNA，高度多样性的ITS序列适合于区分那些16S rRNA基因序列无法鉴别的亲缘关系密切的种以及种内的菌株，是16S rRNA序列测序鉴定菌种方法的补充或替代。ITS序列分析可将16S rRNA基因序列不能区分的堪萨斯分枝杆菌与胃分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌与苏尔加分枝杆菌、龟分枝杆菌与脓肿分枝杆菌、产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌予以鉴别。ITS序列分析与16S rRNA基因分析一样，也不能有效区分海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌。这两种菌DNA杂交所显示出高度相似的基因组以及基本一致的表型特征。但是由于不同种类的分枝杆菌ITS—1序列之间存在碱基的插入和缺失、ITS序列扩增效率低且数据库中保存的ITS序列不全，限制了ITS序列在分枝杆菌菌种鉴定中的应用。

3.热休克蛋白65基因（hsp65）　 hsp65为高度保守基因，但它的高变区可以区分一些16S rRNA基因序列不能区分的密切相关种或菌株。文献报道hsp65基因（88.9%）区分能力高于16S rRNA序列（75.9%），可将鸟分枝杆菌复合群进一步区分为鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌。分枝杆菌hsp65同源基因种内差异性低于16S rRNA序列，低于种间差异，鉴定细菌菌种的准确性更高。但在有些菌种中也存在hsp65基因序列完全一致的问题。

4.RNA聚合酶β亚基基因（rpoB）　rpoB基因是编码RNA聚合酶β亚单位的基因，高度保守单拷贝功能基因，存在于所有分枝杆菌种属中。完整的rpoB基因长度约为3 150 bp，其基因长度短但含有足够的生物遗传信息，可将菌种鉴定至属及种水平。rpoB基因鉴别分枝杆菌菌种的能力优于16S rRNA序列，能够鉴别16S rDNA无法鉴别的菌种或菌株如堪萨斯、胃分枝杆菌、苏尔加和马尔摩分枝杆菌，且分枝杆菌rpoB基因的种内差异为1%～1.7%，低于种间差异，鉴定结果更准确。由于保存的分枝杆菌rpoB基因数据库不完善，因而限制了在分枝杆菌菌种鉴定中的应用。(https://www.daowen.com)

总之，从鉴别能力来看，hsp65优于rpoB和ITS，而16Sr DNA鉴别能力最低。韩国的Kim等选取16SrRNA、hsp65、rpoB等3个基因片段，设计引物后分别对临床分离的109株菌株提取DNA，进行PCR、测序和序列比对，结果发现上述3个基因分别将71.30%、86.79%和81.55%的临床分离株鉴定至菌种水平，3个基因联合分析时鉴定率为97.50%。应用单一的同源DNA序列进行菌种鉴定存在以下不足。

（1） 分辨力不足，一些亲缘关系相近的分枝杆菌无法被准确鉴别。

（2） 单一序列的公用数据库，都可能存在信息不全，或是由于公用数据库在上传DNA序列时，缺乏质量控制等情况，有引起错误鉴定的可能。

（3） 一些新的菌种或亚种的鉴定，往往在联合应用多个同源序列的情况下被发现。