比例法固体药敏试验
（一） 试剂
1.0.5%吐温—80生理盐水 自制，每次试验前现配，121℃30 min消毒后备用。
2.含抗结核药物的无淀粉改良L—J培养基
（1） 含异烟肼（INH）（0.2 μg/ml）的L—J培养基2支。
（2） 含链霉素（SM）（4 μg/ml）的L—J培养基2支。
（3） 含乙胺丁醇（EMB）（40 μg/ml）的L—J培养基2支。
（4） 含利福平（RFP）（2 μg/ml）的L—J培养基2支。
（5） 含对硝基苯甲酸（PNB）（500 mg/ml）的L—J培养基1支。
（6） 含噻吩—2—羧酸肼（TCH）（5 mg/ml）的L—J培养基1支。
（7） 中性L—J培养基2支。
（8） 含卡那霉素（KM）（30 μg/ml）的L—J培养基2支。
（9） 含阿米卡星（AK）（40 μg/ml）的L—J培养基2支。
（10） 含卷曲霉素（CPM）（40 μg/ml）的L—J培养基2支。
（11） 含氧氟沙星（OF）（2 μg/ml）的L—J培养基2支。
（12） 含左氧氟沙星（LFX）（3 μg/ml）的L—J培养基2支。
（13） 含对氨基水杨酸（PAS）（1 μg/ml）的L—J培养基2支。
（14） 含丙硫异烟胺（PTO）（40 μg/ml）的L—J培养基2支。
（15） 含莫西沙星（MFX）（2 μg/ml）的L—J培养基2支。
（16） 含利福布汀（RFB）（20 μg/ml）的L—J培养基2支。
（二） 器材（均需121℃ 30 min消毒）
1.孵育箱。
2.比浊仪。
3.磁珠。
4.一次性10 μl接种环。
5.无菌痰瓶。
6.1 000 μl枪头。
7.200 μl枪头。
8.加样枪（20 μl，200 μl，1 000 μl）。
9.试管（小试管和大试管）。
（三） 操作步骤(https://www.daowen.com)
1.实验前的准备
（1） 提前开启生物安全柜，确认生物安全柜的负压和定向气流运行正常［参见《生物安全作业指导书》（ClinLab—SOP—004）］。
（2） 准备废弃物容器及消毒液。
（3） 标本的核对及编号（编号为试验的流水号）。
（4） 将一次性使用的含0.5%有效氯或75%乙醇的消毒纸铺垫在生物安全柜的台面上。
（5） 在生物安全柜内使用的试验材料和试验标本外表用75%乙醇消毒后放入生物安全柜内。
2.菌悬液的制备
（1） 临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无须传代即可做药敏试验，初生长2周后和贮存培养物需在中性罗氏培养基上传代，取2 ～3周的次代培养物进行试验。
（2） 取上述培养物（需刮取斜面各个部分的培养物）放无菌玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动使呈乳酪样，加入少量0.5%吐温—80生理盐水，静置15 min，用比浊仪比浊配成1 mg/ml的菌悬液。
（3） 在无菌痰瓶中加入1 ml 0.5%吐温—80生理盐水，用接种枪取10 μl 1 mg/ml的菌悬液稀释至10—2 mg/ml和10—4 mg/ml。
3.接种和培养
（1） 用接种枪分别取10 μl 10—2 mg/ml和10—4 mg/ml的菌液，用接种环均匀画线至含药和对照培养基的表面。
（2） 用接种枪取（10 μl）10—2 mg/ml的菌液，接种于PNB、TCH培养基表面，用接种环均匀划线。
（四） 培养
置于37℃孵育4周观察结果。
（五） 结果报告
1.结果观察 对照培养基上菌落生长良好且10—4 mg/ml高稀释度对照培养基上菌落数≥20个，否则重新做。
分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长。
分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4。
分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2。
分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4。
分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面。
培养基斜面上菌落数少于50个时，报告实际生长的菌落数。
2.耐药百分比计算 耐药百分比=（含药培养基上的菌落数/对照培养基上生长的菌落数）×100%。
3.结果报告 耐药百分比＞1%，受试菌对该药物耐药；耐药百分比＜1%，受试菌对该药物敏感。
4.影响药敏结果因素
（1） 用罗氏含药培养基做药敏试验时，其中的磷脂、蛋白、特种氨基酸会影响某些药物的活性，药物受热力和蛋白质吸附作用，损失破坏较多，各种药物破坏程度不一致，在配制过程中虽经提高药物浓度，但不易达到标准要求。米氏7H10和1%溶血半流体培养基可减少上述不足，因其是在制好的培养基内加入抗结核药，避免了受热破坏，同时培养基内蛋白质含量较少，减少了对药物的吸附作用。因此，推荐米氏7H10作为缓慢生长分枝杆菌药敏试验的标准培养基。
（2） 凡用有机溶剂溶解药物，应取加入培养基内溶剂的实际含量做溶剂对照。
（3） 在配制药物原液时，应用药物纯粉剂，在无法获得纯粉剂时，绝不可以用一粒胶囊或一片药的含量代替称量。为减少误差，可取10片药片研成粉末混匀，称其总量折算。