六、操作步骤
（一） 结核分枝杆菌药敏板接种
1.使用前将所有药敏接种培养液恢复至室温。接种时从琼脂板上刮下菌落并乳化于含有0.2%吐温和玻璃微珠的盐水中，用于测试菌种的培养不应超过5周。
2.涡旋振荡器混匀至少32 s。
3.调整浊度至0.5 McFarland标准。如果使用Sensititre Nephelometer比浊仪必须使用0.5 Polymer McFarland标准品校准。浊度测试必须在菌悬液自然沉降15 min后进行。
4.转移100 μl混悬液至含有OADC的7H9药敏接种培养液中，涡旋振荡混匀31 s。得到1×105 CFU/ml［范围为（0.5 ～5）×105 CFU/ml］的接种液。
5.使用八通道移液器或Sensititre Autoinoculator/AIM接种仪接种药敏板。转移100 μl至每个孔中。接种药敏板时，Sensititre标签面向操作者。移液器应定期维护和校准。如果使用Sensititre Autoinoculator/AIM接种板条，需要使用专用加样头。
6.在药敏板完成加样后，31 s内从Autoinoculator/AIM中移走检测管/加样头组合，并倒置存放于试管架中或丢弃。
7.应通过菌落计数法，周期性检验阳性对照孔中接种物浓度（见本书第228页“附件一”）。菌落数应为1×105 CFU/ml［范围为（0.5 ～5）×105 CFU/ml］。整个接种过程必须在30 min内完成。
8.使用黏合密封膜覆盖所有孔，确保所有孔完全被覆盖，以保证足够的密封性。避免褶皱，否则可能导致跳孔。转移到孵育箱前需用消毒液擦拭密封的药敏板。推荐的消毒剂包括带酚基团的化合物如酚衍生物。
9.药敏板在35 ～37℃下有氧环境下孵育，在第3 d观察是否有污染菌生长，在7 ～10 d检查其生长情况。如果10 d后生长情况不好，再放入孵箱，继续孵育药敏板，判读终点21 d。在孵育过程中，最多叠放两块板条。
（二） 纯度检查
为了验证该培养物是单一微生物，需要进行纯度检查。分别取Middlebrook 7H9—OADC菌悬液50 μl在血琼脂平板（BAP）和Middlebrook 7H10平板上划线培养。在35 ～37℃下孵育，BAP平板需48 ～72 h，7H10平板需长达8周。
（三） 快生长非结核分枝杆菌、诺卡菌属和其他有氧放线菌
1.使用前，待所有肉汤自然到达室温。用拭子刮取琼脂平皿上生长的菌落。在去离子水中乳化，目测或者使用Sensititre比浊仪将浊度调整为0.5McFarland标准浊度。如果有可见颗粒物，请充分涡旋震荡。放线菌通常为具有坚硬外壳的菌落。可能有必要与玻璃珠一起进行涡旋振荡，以获取均一悬液。如果涡旋震荡后依然残存大的团块，应当使其沉降，并取上清配制悬液。注意使用含有吐温的水可能会对MIC造成影响。
2.移取50 μl悬液转至含有阳离子调节的Mueller—Hinton肉汤培养基（添加TES缓冲液）的试管中，得到接种液密度是5×105 CFU/ml［范围为（1 ～5）×105 CFU/ml］，充分混合。
3.含有≥32 μg/ml多西环素或米诺环素的药敏板孔位可能会在培养后出现沉淀。可以在添加肉汤前加入5 μl无菌蒸馏水进行复溶，避免沉淀出现。
4.使用八通道移液器或Sensititre Autoinoculator/AIM接种仪接种100 μl肉汤悬液至药敏板上每个孔中。接种药敏板时，Sensititre标签面向操作者。移液器应定期维护和校准。如果使用Sensititre Autoinoculator/AIM接种板条，需要使用专用加样头。(https://www.daowen.com)
5.在药敏板完成加样后，31 s内从Autoinoculator/AIM中移走检测管/加样头组合，并倒置存放于试管架中或丢弃。整个接种过程必须在30 min内完成。
6.应当定期检查阳性对照微孔菌落数（见本书第228页“附件一”）。分离株的接种密度是5×105 CFU/ml［范围为（1 ～5）×105 CFU/ml］。
7.用黏性密封膜覆盖所有微孔，将所有孔按压牢固，确保充分密封。避免折痕，否则会导致“跳孔”。
8.将快生长分枝杆菌在非CO2培养箱中30℃有氧培养72 h。检查生长情况。如果生长不佳，继续培养48 h后读取结果。将诺卡菌和其他有氧放线菌在非CO2培养箱中35℃培养2 ～3 d。龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌的分离株可能需要培养4 ～5 d。CLSI建议将无色素、快生长分枝杆菌培养14 d，确保可以检测出诱导的大环内酯类抗生素耐药性，除非在较早阶段已表现出此种耐药性。药敏板最多叠放3个。
（四） 慢生长非结核分枝杆菌（包括MAC）
对于此类细菌，除了将50 μl菌悬液转移至11 ml Sensititre Mueller—Hinton肉汤培养基（添加有5% v/v OADC生长添加物）的步骤外，采用与上述相同的程序。将试管来回颠倒8 ～10次。这有助于涡旋震荡去离子水和玻璃珠，获取更加均一的悬液。
在非CO2培养箱中35℃培养，并于7 d后读取结果。如果阳性对照生长情况良好，读取结果。否则，重新培养最多14 d。CLSI M24提供了读取指南和不同生长模式的说明。延长培养时间可能需要采取相应措施以避免每个微孔内容物因挥发而造成损失。培养时将平板置于顶部半开的塑料容器中，以促进气体交换。
（五） 结果判读
1.判读时可以使用Sensititre manual viewer或VIZION系统读取结果，亦可使用肉眼进行判读，判读时将药敏板的Sensititre条形码标签面向使用者（请勿揭开密封膜）。细菌生长表现为孔底部出现混浊或菌落沉积。
2.判读时应首先读取阳性生长对照孔。如果在阳性生长对照孔中未出现生长，则结果无效。
3.在判读结核分枝杆菌异烟肼、利福平、莫西沙星、氧氟沙星、环丝氨酸、阿米卡星和卡那霉素药敏结果时，其MIC时为该抗生素生长明显抑制、完全无生长迹象的最低抗生素浓度。而在判读链霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、利福布汀和乙胺丁醇时，其MIC为该抗生素生长受到约80%抑制的最低抗生素浓度。
4.在判读非结核分枝杆菌药敏结果时，除磺胺类药物之外，MIC是指完全抑制生长的最小浓度，而磺胺类药物MIC是能够抑制80%生长的最低浓度。
5.判读结果时需注意以下几种情况。
（1） 污染：如果在孵育3 d时观察到有孔内有细菌生长，可视为污染。污染也可导致一个孔内有生长，周围临接的孔没有生长的情况。单个孔污染可以忽略，但如果多个孔怀疑被污染，则应重新试验。
（2） 跳孔：有时会出现“跳孔”（一个孔显示没有生长，而周边邻近的孔显示生长）。对此现象有多种解释，包括污染、突变、封膜褶皱或接种错误。单一的跳孔可以忽略不计。但为保证有效的抗生素治疗，请不要把跳孔判读为MIC，而是应读取连续没有生长的药物浓度最低的孔为MIC。
（3） 混合培养物：除了上述（1）中说明的情况外，如果出现两个终点值，表现为一个清晰的“纽扣”状生长，跟随几个弥漫性生长后就不再见“纽扣”状生长（或纽扣变小），则有可能是混合细菌生长。应在适当的琼脂培养基上进行再培养以检测纯度。如果检测到混合培养，那么试验结果无效。