MALDI—TOF MS 技术在分枝杆菌鉴定中的应用
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI—TOF MS），是近年快速发展起来的一种新型软电离生物质谱，具有强大的应用潜力，可对多种类型的样本进行分析，包括蛋白质、脂类、核酸、多肽及其他能被离子化的分子，是临床微生物鉴定领域最具代表性的技术发展之一。与传统的微生物生化鉴定技术或测序技术相比，MALDI—TOF MS技术具有操作简单、准确度高、试剂成本低等优势，同时在苛养菌、厌氧菌、真菌和分枝杆菌等的快速准确鉴定方面也弥补了传统生化方法的不足，使得其在临床微生物检测领域获得了越来越广泛的认可和应用。当以基因测序作为参比方法进行对比时，MALDI—TOF MS的鉴定能力要强于传统的生化鉴定方法。目前Biotyper（Bruker Daltonics，德国）、Vitek MS（Biomérieux，法国）两种质谱系统在国内已取得国家药品监督管理局许可证，为目前国内实验室常用质谱鉴定系统。国产质谱仪Clin—TOF也已通过国家药品监督管理局认证。(https://www.daowen.com)
MALDI—TOF MS鉴定细菌通常需要105 ～107菌落形成单位（CFU）的菌量。MALDI—TOF MS鉴定菌种的准确性与物种的亲缘关系和参考光谱的覆盖程度相关。目前，德国Bruker Mycobacteria Library 5.0版本共含有853个光谱，可鉴定159种分枝杆菌。法国RUO数据库v4.12版本包含了1 286个光谱，可鉴定45种分枝杆菌。
MALDI—TOF MS能够用于病原微生物诊断主要基于以下几点：不同微生物指纹图谱的差异；指纹中存在种属、亚种间特异的模式峰；相同的培养和操作条件下其鉴定结果具有可重复性。MALDI—TOF MS技术相对于传统的测序方法以及色谱法来说，不仅能快速检测大量未知蛋白质，而且对蛋白质的种类能进行分离，这体现MALDI—TOF MS技术在鉴定细菌方面的优势。常规方法一般是在微生物培养后进行蛋白质抽提，用质谱进行分析。
Nicole等利用质谱方法分析人血清样品外泌体（exosomes）中的8个结核标志蛋白质（Antigen 85B，Antigen 85C，APa，BfrB，GlcB，HspX，KatG和Mpt64），从而对活动性和潜伏性结核进行鉴别诊断。Schuberb等介绍了质谱不仅仅能够通过潜伏存活调节子在厌氧条件下的调节，对体外培养的结核分枝杆菌蛋白质进行鉴定和定量检测，并且能够用于受感染细胞、动物模型中结核分枝杆菌的鉴定。
MALDI—TOF MS的核苷酸检测法可以检测分枝杆菌对多种一线和二线抗结核药物（利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、链霉素、乙胺丁醇、氟喹诺酮、乙硫异烟胺）的耐药基因突变（rpoB、katG、inhA、pncA、rpsL、embB、gyrA），其检测到的突变和Sanger测序结果完全一致，以药物敏感试验为参考方法，MALDI—TOF MS的检测结果有90.6%的一致性。
MALDI—TOF MS还存在一些局限性。如不能区分结核分枝杆菌复合群中具体菌种，只能对纯培养的菌落进行鉴定，不能用于对临床标本和混合培养物的直接检测，对慢生长的分枝杆菌或真菌，直接使用标本进行DNA测序或基因杂交，更能更早得到鉴定结果。菌株破壁效果直接影响是否有足够的蛋白用于质谱分析，是决定鉴定能否成功的前提。早期的研究通常直接对分枝杆菌细胞进行分析，不仅存在安全隐患，且质谱峰的质量易受杂质峰（脂质和多糖）的干扰，影响鉴定结果准确性。Machen等分别用加热灭活法和细胞破碎法提取107株临床分离株蛋白，结果显示两种方法分别有82.2%和88.8%鉴定至种属水平，且后一种方法将出结果所需时间减少到1 h以内。不同仪器鉴定结核分枝杆菌和NTM的能力为：Bruker Biotyper鉴定为84.7%、VITEK MS为89.2%和Saramis为85.4%。Bruker于2013年和2014年发布的2种蛋白提取方法，结果显示采用2013版的提取方法，固体培养基的鉴定正确率明显高于液体培养（71.7% vs 44.7%），而采用后者的提取方法，鉴定正确率没有明显差异（70.8% vs 75%）。质谱仪数据库还有待于进一步的完善，还不能满足临床阳性检出率和检测准确度的要求，数据库还有待于进一步扩充。
（张丽军 卢洪洲）
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