结核抗原检测及局限性
（一） MPB64蛋白检测及局限性分析
1.原理 MPB64蛋白为结核分枝杆菌复合群特异的早期分泌蛋白，分子量为24 kDa，生长过程中能够分泌到菌体外，易被检出。它是在牛结核分枝杆菌弱毒株BCG中的培养液中首次分离。通过使用单探针法克隆仅在结核分枝杆菌的培养滤液和一些牛结核分枝杆菌BCG菌株中发现的免疫原性蛋白MPB64的基因并测序。基因分析表明，MPB64的结构基因由618个碱基对组成，其推导分子量为22 400。观察到假定信号肽的22个氨基酸和MPB64蛋白的205个氨基酸。在编码区中，密码子的第三个字母显示有偏向的密码子和高G + C含量（78.5%）。通过使用大肠埃希菌表达载体在大肠埃希菌中表达该基因。该产物通过电泳显示出与真正的MPB64蛋白类似的迁移，并与针对MPB64蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体反应。MPB64的严格特异性可用于结核病的免疫诊断。
2.应用
（1） MPB64—PCR：MPB64蛋白为结核杆菌复合群（MTBC，包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）所特有。根据该蛋白的基因序列设计的引物进行PCR，对MTBC模板DNA显示出高特异性。
（2） MPB64—ICA：应用胶体金标记抗MPB64单克隆抗体采用免疫色谱分析（MPB64—ICA）进行MPB64分泌蛋白检测。该测试非常简单，不需要仪器，非常快速，可以在液体和固体培养基中进行。本章节主要针对此方法进行详述。
3.操作步骤 对于在固体培养基生长的菌落，在培养阳性管中加入0.5 ml的生理盐水，用接种环刮取菌体，在管底轻轻研磨，待用。液体培养阳性，经抗酸染色证实，可直接检测。取上述菌液100 μl滴入检测板的样本孔，15 min内观察结果。
4.结果判定 ① 阳性：检测线及质控线都出现紫红色条带。② 阴性：只有质控线出现紫红色条带。③ 无效：质控线处无显示紫红色条带，应考虑检测或者试剂质量有问题，再用其他检测板重新检测。
5.结果报告 检测线及质控线均出现紫红色条带，报告：结核分枝杆菌复合群，具体见下页图7—2—3—1。仅质控线出现紫红色条带，报告：MPB64蛋白阴性，具体见下页图7—2—3—2。
6.注意事项
（1） 样本量太少时，有时不能正常反应。
（2） 培养后的样本尽快用于测定。
（3） 培养基中的培养菌株有感染性，请慎重处理。
（4） 为防影响质量，试剂盒保存于2 ～30℃环境中，避免高温多湿及阳光直射。
（5） 请在样本滴下后15 min以内进行判定。
图7—2—3—1 液体培养阳性，MPB64胶体金阳性
图7—2—3—2 液体培养阳性，MPB64胶体金阴性(https://www.daowen.com)
（6） 测定使用完毕的检测板、试管、残余样本等，在废弃前必须用121℃高压灭菌处理15 min以上，或者用2.5%的次氯酸钠浸泡10 min以上。
7.检测方法的优缺点
（1） 优点：MPB64—ICA可以快速区分结核分枝杆菌复合群（MTBC）感染和非结核分枝杆菌（NTM）感染。正确检测结核分枝杆菌复合群和MOTT杆菌的混合培养物中的结核分枝杆菌复合群，也可以很容易地用于结合基于液体培养基的培养系统快速鉴定结核分枝杆菌复合群，而临床实验室没有任何技术复杂性。
（2） 缺点
1） 金黄色葡萄球菌可能分泌某种与MPB64相似的蛋白质，从而干扰MPB64的检测，必须排除没有金黄色葡萄球菌生长而产生干扰，这样才能减少假阳性。
2） 用含树脂需氧瓶中的肉汤进行MPB64检测，会出现假阳性反应。
3） 结核分枝杆菌复合群中，BCG的几个亚株（Copenhagen株、Glaxo株、Pasteur株、Tice株）不产生MPB64，所以判定为阴性。
4） 测定结果为阳性，只是表明样本中有结核分枝杆菌存在，也可能存在结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌复合群感染。
5） 检测灵敏度与MPB64抗原的分泌量有关，有些标本液体培养如BD960培养阳性，MPB64抗原检测阴性，通过延长培养时间后可获得阳性结果。
6） 当编码MPB64抗原的基因突变时，会出现假阴性结果，发生突变的概率为0 ～3%。
7） 个别NTM菌种如海分枝杆菌和浅黄分枝杆菌，可产生微量的MPB64抗原，检测呈弱阳性结果。
8） 有污染菌共生长的结核分枝杆菌阳性液体培养管，有时会出现假阴性结果。
（二） TB—LAM试纸条法
1.脂阿拉伯甘露糖（LAM） 该物质是结核分枝杆菌细胞壁成分，结核分枝杆菌合成旺盛，分子大小≈肌红蛋白，结核病患者尿液中通常发现LAM。见下页图7—2—3—3。
2.TB—LAM检测效能 来自一项南非的评估，纳入500名住院患者，培养作为金标准，涂片灵敏度为42%（36%～50%） 。
TB—LAM灵敏度：HIV阳性患者为67% （59%～74%） ，HIV阴性患者为14% （3%～41%）。
TB—LAM特异度：96%（91%～99%）。