粪菌移植技术的应用
【概述】
正常人的肠道内寄居着约100万亿个共生菌，其中约有1000余种菌属，数量庞大，结构复杂，这些肠道菌群是人体不可缺少的一部分，维持着肠道内环境平衡，在机体代谢、免疫等方面发挥重要的作用。当菌群结构紊乱、保护性菌群减少时，机体就会出现疾病状态，包括感染、炎症，甚至肿瘤。近年来，粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）技术引起国内外研究者的广泛关注，通过提取健康捐献者粪便中的远端肠道菌群，移植到菌群紊乱患者的胃肠道内，可持久地改变肠道微生态，保持肠菌多样性，帮助患者重建结构分布正常的功能菌群，从而实现复发性难辨梭状芽孢杆菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）等一系列肠道或肠道外疾病的诊疗。早在1700多年前中国就有粪水治疗食物中毒和严重腹泻的记载，但当时缺乏诊疗依据，而且该疗法接受度低，因此很少再有应用。1958年，美国外科医生Ben Eiseman等报道了4例严重伪膜性肠炎（即CDI）患者经过氢化可的松、抗生素等常规治疗后仍严重腹泻，生命垂危，试用健康家属的粪水灌肠后，其中3例在几天之内奇迹般康复，另1例死于非肠道感染的其他疾病，然而该疗法仍未引起足够重视，直到20多年后研究发现CDI与抗菌药物的使用密切相关，FMT在严重或复发性CDI治疗中的疗效才逐渐得到认可。此后，尤其是近5年，大量病例报道、回顾性分析和高质量的随机对照研究进一步证实FMT对于严重或复发性CDI治疗效果显著，并于2013年被列入美国治疗复发性CDI的临床指南。同时，该项技术亦被应用于治疗其他与菌群紊乱相关的疾病，如炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）、肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）、代谢综合征等，目前多项关于其疗效和安全性的临床研究正在进行。
【机制】
FMT治疗CDI的机制尚不明确。一般认为，是由于健康捐献者的粪菌能够在受者肠道内持久发挥作用，使受者肠道菌群的结构和功能发生改变，最终重建适合受者的功能菌群。患者肠道内菌群种类数明显减少是CDI的致病基础，最主要的危险因素是抗生素的使用，其次是宿主易感性、饮食和环境因素等。新植入的健康菌群通过恢复肠菌多样性、增加次级胆汁酸生成、产生大量丁酸盐产物等促使肠道免疫屏障形成，进而抑制难辨梭状杆菌的生长并使之丧失活性。近年来，下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的发展有助于直观了解FMT后肠菌种类的变化，并可分析FMT发挥作用的原因。研究发现，患者在成功移植健康粪菌后，肠道微生态改变，厚壁菌门、拟杆菌门恢复其优势地位，而变形杆菌门则相对减少，此环境有助于肠道免疫系统彻底清除难辨梭状芽孢杆菌。有研究者观察到毛螺菌属在严重CDI患者肠道内显著减少，而实施FMT成功后其数量恢复，提示毛螺菌属可能起到保护作用。另有文献显示苏云金杆菌可分泌一种细菌毒素分子，特异性攻击革兰阳性细菌包括难辨梭状芽孢杆菌。此外，优势菌群的其他成员亦通过分泌相似的毒素分子达到抗菌效果。而在IBD、IBS、代谢综合征等疾病中，肠道菌群的致病机制较CDI更为复杂。虽然目前对各种细菌之间以及与宿主之间的相互作用还知之甚少，但以肠道微生物为基础的治疗已经发展成为这些疾病诊疗的重要方法。常用的益生菌治疗由于制剂中的细菌种类一般仅为2～3种，其疗效受到限制；而FMT技术，作为人类唯一没有排斥反应的“器官”移植，操作简单且疗效显著，具有极大的临床应用价值和前景。
【适应证】
1.CDI 近年来，随着抗菌药物的广泛使用及人口老龄化等问题，难辨梭状芽孢杆菌出现多重耐药性，CDI的发病率和严重程度在全球范围内呈上升趋势，传统的抗菌治疗往往易复发。文献报道，FMT治疗严重或复发性CDI的疗效明确。2012年，Brandt等的多中心研究发现，FMT治疗CDI的总治愈率高达98%，其中，91%的患者通过一次移植即治愈。2013年，FMT治疗方案被列入美国治疗CDI的临床指南，提出以下FMT指征：①反复发作3次以上的轻至中度CDI，应用万古霉素冲击治疗效果不佳者；②至少2次CDI发作需要住院治疗者；③中度CDI经标准治疗1周而无效者；④重度CDI经标准治疗48h而无效者。
2.IBD 包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn'sdisease，CD），其发病与肠道菌群失调密切相关。1989年Bennet首次报道FMT成功治愈1例严重UC患者，由此拉开FMT技术应用于IBD治疗的序幕，因其巨大的临床价值，近几年来逐渐成为研究热点，然而各临床中心的疗效结果却不尽相同。Brody等对6例接受美沙拉嗪和（或）免疫抑制剂治疗的重度UC患者进行FMT治疗，所有患者在内镜和临床表现两方面均得以缓解；但Angelberger等在2013年发表的文献中指出，部分UC患者经过FMT治疗后发热和腹泻症状反而加重，提示病变范围、随访时限等因素均会影响其疗效分析。2015年在Gastroenterology杂志发表了两篇关于FMT应用于UC患者治疗的随机对照研究，其中一篇是将75例活动性UC患者随机分组，一组给予每周FMT治疗，另一组用清水灌肠作为对照，共治疗6周，结果显示FMT组在临床表现和内镜下黏膜愈合两方面均较对照组显著好转，差异有统计学意义；另一篇荷兰学者的研究中则纳入50例轻到中度活动性UC，同样随机分为FMT组和对照组，分别在开始时和3周进行治疗，结果仅37例患者最终完成，两组之间的临床和内镜缓解率没有明显差别。这两项研究间结果的差异可能是由于供者选择、移植途径和移植频率等的不同。因而，对于FMT治疗UC的疗效尚无定论，今后还需更多的大样本量随机对照研究加以验证。另外，我国曾有一例FMT治愈严重CD伴窦道形成的病例报道，但是关于FMT治疗CD的报道较少，迄今总共仅6例，总体分析显示其临床效果与常规治疗相比，差异无统计学意义。总之，FMT技术在IBD治疗中的作用仍有待进一步研究。
3.IBS 大量研究发现IBS的发病与肠菌种类减少、生理屏障破坏、器官敏感度增高、脑肠轴等机制相关，而FMT能缓解IBS患者的症状同样亦证明了菌群作用在该疾病发生发展中的重要性。早期有一些FMT治疗后IBS患者症状好转的文献报道，如Andrews等在一项长期随访研究中发现，约90%便秘型IBS患者的临床表现在FMT治疗后立即缓解，在随后9～19个月的随访中60%的患者症状长期改善。然而这些研究样本量小且缺乏对照，其结果需谨慎分析。
4.肥胖和代谢综合征 现在大多数学者将肥胖视为一种病态，肥胖不仅给生活带来诸多不便，还易并发多种疾病，如高脂血症、冠心病、脑卒中等。Vrieze等报道，将苗条供者的粪菌悬液经鼻空肠管移植到肥胖者肠道内，肥胖患者的胰岛素敏感性在6周后显著上升。这项研究开启了FMT技术应用于肥胖、代谢综合征和2型糖尿病等慢性疾病治疗的新篇章，但其作用机制、有效剂量、给药途径、临床疗效等还需深入研究。
【操作流程】
1.供者选择 需满足以下条件：①无任何已知的传染病，近6个月内未到地方流行性腹泻地区旅行；②近3个月内未使用抗菌药物或导致肠道微生态紊乱的药物；③无胃肠道肿瘤、IBD、IBS等消化系疾病；④无胃肠道手术史；⑤无其他系统恶性肿瘤病史；⑥无自身免疫性疾病史；⑦无内分泌代谢性疾病史；⑧无其他相关危险因素，如吸毒、高危性行为、精神异常等。供者可以是患者的一级亲属、夫妻、朋友或无血缘关系的健康捐献者，需遵循知情同意原则。一级亲属与患者有相似的肠菌环境，故移植后的黏膜免疫系统会产生耐受性较高的获得性免疫抗体，但如果肠道疾病有遗传性因素存在则不适合；患者与妻子或丈夫由于生活在同一个环境里，移植可能相对减少交叉感染的风险，但亦有可能接触相同的环境危险因素；理论上男性捐献者优于女性，因为女性更可能携带与自身免疫性疾病或IBS相关的基因。故选择合适的供者需综合考虑以上优、缺点，并在操作进行前4周之内完成供者血清常规、生化、病原学筛查，以及粪便病原学检查，包括CDI毒素、沙门菌属、志贺菌属、大肠埃希菌O157、弯曲杆菌属、金黄色葡萄球菌属、耶尔森菌属、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、白念珠菌、轮状病毒、隐孢子虫、环孢子虫等的检测，以确保该操作的安全性。
2.供体制备 将粪便与无菌水相混合，随后经过初步过滤、逐级过滤、离心后悬浮，最后得到几乎无色无味的粪菌液，可立即用于移植，亦有报道称在粪菌液中加入无菌甘油后冻存于-80℃可保存1～8周。
3.移植途径 包括上消化道途径，即通过鼻胃管、鼻空肠管和胃镜将粪菌液置入上消化道，管道拔除后即可正常饮食；下消化道途径，包括结肠镜或者保留灌肠途径，移植后嘱患者半小时内避免排便。各途径均有利弊，目前，对于最佳移植途径尚无定论。上消化道途径易造成呕吐和误吸，而且患者心理上较难接受；结肠镜途径可在移植的同时详细检查全结肠，然而操作费用高，同时存在穿孔、出血等内镜操作相关风险；而保留灌肠途径，虽然价格便宜、操作危险性小，但留置管道会带给患者行动不便和感染风险，并且多次灌肠对供体需求非常高。而新型FMT实施形式如冻粪胶囊或生物合成制剂，有望于未来几年内成为FMT治疗方案的备选样本形式。
4.移植前准备 患者准备移植的前3日停用一切抗菌药物；无论接受何种移植途径，均需肠道准备；如通过上消化道途径，移植前一日晚上和当日早上给予PPI；如通过下消化道途径，移植时给予抗胃肠运动药物，以便粪菌液在肠道保留，从而发挥作用。
5.移植后随访 一般在移植后2周、4周、3个月、6个月、1年分别进行随访。主要随访内容是FMT的安全性评估和疾病缓解的判断，检测相关血清、粪便等指标，必要时行内镜检查。
【安全性】
FMT技术的应用推广存在两大阻碍：一是患者心理上较难接受，这是对传统美学标准的一种挑战；二是供体质量和移植安全性的控制问题。对于第一点，有人做过调查，患有CDI者如果病情复发，97%的患者表示愿意接受FMT疗法，53%的患者愿意将FMT技术作为治疗复发的首选，说明疾病的痛苦还是会改变大部分患者的想法。尤其是现今飞速发展的自动化设备和经胶囊给细菌等技术将使FMT更加标准化、人性化，有助于消除患者心理抵触，从而真正推动该项技术的迅速发展和广泛应用。对于第二点，可通过检测供者血清和粪便中多种病原微生物，尽可能避免交叉感染，但相关风险仍然存在。一个临床中心报道了2例FMT后发生诺瓦克病毒感染，分别在移植后2日和12日。而另一项多中心回顾性研究中，FMT被应用于免疫力低下且患有CDI的人群，在这些高危人群中并无一例并发感染，说明此项技术的短期安全性较高，但仍需进一步随访，因为理论上可能有尚未发现的病原体，潜在的远期感染风险始终存在。
FMT的短期不良反应包括上腹部不适、腹胀、腹泻、呕吐、一过性发热等，亦有移植时误吸、移植后出血、穿孔的报道，这些不良反应与内镜操作和麻醉风险相关。迄今为止有2例移植后死亡的病例报道，其中一例的原因是误吸，另一例是在移植后13日因重症肺炎而死亡，但此例肺炎在FMT之前已经存在，患者死亡可能与FMT技术本身无关。
远期不良反应主要是指肠道菌群的变化可能诱导多种代谢性疾病、心血管疾病、肿瘤、精神性疾病等，对受者身体造成长期的潜在影响。有动物试验证实，将苗条小鼠的粪菌移植到肥胖者肠道内可显著增加胰岛素敏感性、产生大量丁酸盐产物等；同样，肥胖小鼠的粪菌亦可传递肥胖基因表型，这是形成代谢性疾病的发病基础。另有研究显示，肠道细菌分解食物中的肉碱或其他营养物质时，会产生代谢产物三甲胺-N-氧化物，后者可增加患心脏疾病和心血管事件发生的概率。而肠道黏膜局部菌群持续与肠上皮细胞相互作用，可能是结直肠癌（colorectal cancer，CRC）及其癌前疾病的病因学因素，一些肠道菌群通过影响人体的代谢和免疫系统而导致结直肠甚至整个消化系统的生理状态和功能发生变化，进一步促使CRC发生和发展。因此，FMT可能存在未知的潜在风险，而目前缺乏关于FMT远期疗效和不良反应的相关报道，故FMT前需慎重考虑其远期影响，并在指征明确的情况下进行，长期的前瞻性随访研究对该技术的安全性评估至关重要。
关于儿童患者使用FMT的疗效和安全性数据较少，其结果尚有争议。2010年，Russell等报道了首例儿童复发性CDI患者接受鼻胃管途径FMT疗法。该名2岁儿童患者在经历了益生菌制剂、甲硝唑、万古霉素、利福昔明等治疗失败后进行FMT，移植后36h之内完全康复。在此报道之后，陆续多项研究综合显示FMT治疗儿童复发性CDI的治愈率达92%，而且没有严重不良反应的报道。虽然未发现短期的不良反应，但研究者认为儿童患者应用FMT技术较成人风险更大，因为至今尚不明确移植后肠道微生态变化对人体，包括对儿童生长发育、免疫防御等的长期影响。
【总结和进展】
综上所述，FMT技术在治疗严重或复发性CDI具有良好效果，并且在IBD、IBS、肥胖等肠菌相关性疾病的治疗方面具有潜在的临床应用价值，短期不良反应少见，但其远期疗效和安全性仍有待大型前瞻性临床研究进一步验证。我国的现状是，各临床中心的供体筛查内容、制备方式及有效剂量等尚无统一标准，监管组织和框架存在一定缺陷，故临床上实际应用有限。但在无其他选择时，FMT仍是严重肠道菌群失调、慢性难治性肠病，尤其是复发性CDI的最佳治疗方案。相信今后，随着相关治疗指南的逐步完善及自动化设备和相关技术的飞速发展，FMT技术在国内将走向规范化、人性化，从而推动其发挥更大的临床价值。2013年Petrof等研究者从健康人粪便中分离出33种细菌培养制成的细菌混合物，成功治愈2例复发性CDI患者，提供了粪人工组合菌群移植（synthetic microbiota-transplantation，SMT）代替FMT的可能性。若能全面实现标准化SMT，通过人工培养组成最佳比例和数量的特定菌群，不仅可针对不同疾病进行特异性治疗，还可确保供体安全性，达到有效质控。此疗法将改变当前“全粪便”移植的非特异性治疗模式，同时还可将人工培养菌群制成冻干粉，实现以胶囊形式直接口服等途径，将会是菌群移植技术的一次革命性发展。
（邹天慧 陈萦晅）