诊断与鉴别诊断
非特异性检查:常规血常规检查多提示血白细胞正常或稍增高,血沉加快。血钠降低(＜130mmol/L),偶见血钙、磷降低。也可有高胆红素血症,血清中谷草转氨酶(SGOT)、谷丙转氨酶(GPT)和碱性磷酸酶浓度升高。肌酸激酶升高常见,低蛋白血症、一过性血糖增高、血尿素氮和肌酸轻度异常,血肌酸激酶可轻度升高。脑脊液通常正常。总体而言,该病的临床表现缺乏特异性,因此病原学检查对确诊军团菌肺炎意义重大。目前常用的诊断方法主要有:军团菌培养、免疫学方法检测抗原或抗体以及分子生物学方法检测核酸。
(一)分离培养法
分离培养出军团菌是诊断军团菌感染的金标准,分离出的菌株可进一步进行种、型的鉴定。主要采集的标本为下呼吸道分泌物,包括痰(最常用)、经气道吸出物、支气管肺泡灌洗液等,其中以支气管肺泡灌洗液培养阳性率最高。胸腔积液、肺组织活检标本亦可用于培养。
分离培养困难、费时长(对早期诊断意义有限)、部分病人无痰或痰量很少是培养法于临床应用受限的主要原因。军团菌生长依赖半胱氨酸,常用的营养培养基为活性炭酵母浸液琼脂(bufferedcharcoal yeastextract,BCYE)培养基,一般需培养3～5天,某些非嗜肺军团菌培养时间可长达2周。
(二)尿抗原检测法
能够可以快速、早期诊断是尿抗原检测法(UAT)的最大优势,并且不受治疗的影响,检测靶点是嗜肺军团菌细胞壁的脂多糖。尿抗原阳性是军团菌感染的确诊标准。病人出现临床症状后的2～3天尿中方可检测到抗原,通常在发病1～2个月后尿抗原转阴,但个别病人尿抗原阳性可达300多天。检测尿抗原的方法包括免疫层析法(ICT)和酶免疫测定法(ELISA)。免疫层析法操作简便、快速(15～30分钟),主要用于床旁检测的定性诊断方法,在欧洲和美国已广泛应用于临床,在确诊的军团菌感染病例中,应用此方法诊断的病例分别占82%和97%。Meta分析显示,该方法的灵敏度为74%,特异度可高达99.1%。UAT的不足之处是仅对LP1型军团菌敏感,敏感度达80%～90%,而对非LP1型军团菌敏感度＜50%,对LP1型菌株mAb3/1位点阴性的菌株也不敏感,因此易出现漏诊,假阴性率达26%,在以非LP1型军团菌为主要流行菌的区域降低了其临床应用价值。
(三)免疫学方法
主要包括血清抗体检测法和检测呼吸道标本或组织标本抗原的直接荧光抗体法。
1.血清抗体检测法 是指检测血清标本中军团菌免疫球蛋白IgG和IgM抗体的方法,包括间接荧光抗体法(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、试管凝集法、玻片凝集法等。方法不同敏感度、特异度亦不相同。其中IFA和ELISA法应用最为广泛,最早应用于军团菌血清抗体的检测方法是IFA法,与ELISA法敏感性及特异性相似,二者相比,ELISA法因其快速、方便、自动分析结果客观准确,目前多被临床采用。该方法需要急性期和恢复期(3～8周)双份血清样本,当抗体滴度明显升高(≥4倍)时有诊断意义,因此对疾病早期诊断价值有限,但对于军团菌流行病学调查及回顾性分析仍有帮助。
2.直接荧光抗体法(DFA) 是应用军团菌抗体检测病人呼吸道标本或组织标本中的抗原,可在2小时内取得结果,能进行相对快速诊断。DFA阳性对军团菌感染有诊断意义。即使病人应用抗菌药物治疗数天后仍可检出抗原,因此不受治疗影响但会因交叉反应引起假阳性。由于该方法对技术设备要求高,并且试剂昂贵,目前在临床上应用较少。
(四)核酸扩增法(https://www.daowen.com)
聚合酶链式反应(PCR)和实时PCR(RT-PCR)是检测军团菌核酸最常用的方法,近年来环介导等温扩增(LAMP)等技术也应用于临床。检测标本主要为下呼吸道分泌物,也可以用组织活检或胸腔积液标本,而血液和尿标本较少用,阳性率低。常用的检测位点包括16SrRNA、5SrRNA、mip基因、16S～23S间区等。这些扩增的基因片段存在于军团菌属细菌,并在嗜肺军团菌菌株中高度保守,理论上可检测所有军团菌种的细菌。核酸检测阳性对军团菌感染具有诊断意义,尤其对相对轻症、军团菌培养阴性的病人,该方法有诊断价值,是有应用前景的早期诊断方法。不足之处是该方法需要昂贵的仪器设备和专业技术人员。
(五)其他检测方法
近年来研发的新的检测方法包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)法和流式细胞仪法。MALDI-TOF-MS法是通过分析蛋白表达谱来鉴别微生物,在军团菌属和种的水平检测敏感度分别为99.2%和89.9%,缺点是无法区分军团菌血清型,且存在假阳性。流式细胞仪技术是以评价细胞的荧光性为基础,可从呼吸道标本中检出军团菌,还可以快速评价军团菌的药物敏感度。由于这两种方法对实验仪器设备以及实验技术要求较高,目前在临床上应用受限。
(六)影像学检查
军团菌肺炎的胸片无特异性,早期可见斑片状阴影,多为单侧受累,多不呈叶、段分布,后期可转为浓密实变阴影,邻近及对侧肺叶受累,而且病变区常合并肺的间质纤维化。病变表明军团菌肺炎的影像学动态变化一般迟于临床症状的变化,且临床症状好转或消失时影像学异常仍可继续存在甚至加重。结合实验室检查、临床症状、体征及治疗情况,影像学对军团菌肺炎诊断是可行的,甚至可以尽早得出本病的正确诊断。各种诊断方法的比较见表3-3-1～表3-3-3。
表3-3-1 军团菌病原实验室抗体测定
表3-3-2 军团菌病原实验室免疫荧光法测抗原
表3-3-3 军团菌病原实验室培养
