聚合酶链反应与中西医结合研究

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是基因工程领域的一项新技术。1985年，Saiki等人首先报道了PCR，随后Mullis和Falocn等人也相继报道了这是一种更快、更有效和更专一的DNA分析技术。Mullis曾因此获得两次诺贝尔奖，这表明它的重要作用和光明的前景。

PCR是一种由两个引物介导的特异性DNA序列的体外酶促扩增，在扩增反应中，需要DNA聚合酶与大量的上下游引物和4种脱氧核糖核酸三磷酸相互作用。反应过程中，首先，通过加热使DNA变性，双链DNA变为单链DNA，然后将反应混合物冷却到一定温度，使上下游引物与特定DNA序列的模板互补，这就是退火温度，退火温度是根据两个引物的长度来计算的，之后，用DNA聚合酶将退火后的引物迅速延伸到引物的另一端，以单链DNA为模板，可以扩增出特定的DNA序列，通过反复的变性、退火和延伸的多次循环，扩增特定的DNA序列。PCR扩增约需要20～40个周期，使待扩增的DNA指数级增加，可达原来的106倍，如需继续扩增，可对产物进行稀释，为后续各轮反应模板进行新的PCR。

PCR技术最重要的特点是可以在数小时内完成大量扩增，省去了大量微生物的培养、纯化和鉴定过程。早期，PCR反应所用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段，它不耐热，在如此高温下的多次循环中，需要在每一步开始都要加入新的聚合酶，程序非常复杂。后来，生物学家通过大量研究发现了耐高温的DNA聚合酶，即Taq-DNA聚合酶，此酶具有反复加热后不失活的优点，为PCR反应提供了良好的条件。

PCR技术提供的模板不仅限于DNA，还可以mRNA作为模板与反转录结合产生第一链。这种方法被称为反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），它可以在一个或几个细胞中检测到10个拷贝以下的特异性cDNA。它为获得和扩增特异性cDNA提供了一种非常简单有效的方法。

因为PCR反应是在三种不同的温度下进行的，原来的方法是三种不同温度的水浴，手动来回切换，并且一直要等到几十个循环结束，为了使这一过程自动化，科学家们研究出了PCR反应仪。

PCR和RT-PCR都不能对DNA进行定量分析。实时荧光聚合酶链反应（QPCR）是指在PCR过程中（即实时）监控PCR过程的能力。因此，可以在PCR扩增过程中而不是在PCR结束后收集数据。这彻底改变了基于PCR的DNA和RNA定量方法。在Q-PCR中，反应的特征是循环中第一次检测到目标扩增的时间点，而不是目标分子经过一定周期后的累积扩增。目标核酸的初始拷贝数越高，荧光的显著增加就越快。相反，终点试验即“读板试验”测量PCR循环结束时积累的PCR产物的数量。Q-PCR的基本特点是：①用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。②荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。③动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，因此具有高效和快速的特点。

目前，PCR技术已被广泛应用于医学研究：①遗传性疾病的基因分析，如α-地中海贫血的Batr’s胎儿水肿综合征的诊断；在136bp处用PCR和限制性内切酶片段长度多态性（RELP）连锁分析鉴定该基因的缺失与否，对甲型血友病做出基因诊断。②肿瘤疾病的基因诊断与治疗。③传染病病原体如细菌和病毒的检测，特别对艾滋病和性病的检测是非常重要的。

PCR技术在法医学、农业和考古等领域的广泛应用与其迅速发展的科学性、重要性、简便性和快速性密切相关。在海外留学生中，有许多中医学人才从事分子生物学技术研究，他们对中医学界研究的发展有着相同的思考。我国有着几千年的中医药防治疾病的历史，如何用先进的分子生物学技术研究中医药具有重要意义。1995年，中国中医科学院在其院报发表了《PCR技术与DNA指纹图谱》的文章，提出应用PCR技术鉴别中药真伪。香港中文大学中药研究中心的科研人员采用随机引物PCR（AP-PCR）和分子标记技术（RADP）对中国人参和西洋参的DNA指纹图谱进行了鉴定，客观地解决了传统生药学无法解决的问题。因此，PCR技术在中药领域的应用前景广阔，将在中药的鉴定、分类、质量、有效成分的改良、品种改良、病虫害抗性的提高和动物药物转基因研究等方面发挥积极作用来源，并将得到广大科研人员的认可，最终将推动中医药研究的发展和进步。

（田欢）