体细胞检测方法
(一)标准方法
体细胞计数的标准方法为染色体镜检法,采用ISO13366-1:1997《生鲜牛奶中体细胞的测定方法》第1部分显微镜法(见NY/T800-2004)。在实践中的具体应用参见本节后的附件A。
(二)荧光显微镜计数法
与标准的亚甲基蓝染色镜检法比较,荧光显微镜计数法的优点是荧光细胞很易与周围背景相区别。如果使用吖啶橙作染色剂,则细胞核和各种粒状物都能清楚地呈现出来,这样荧光细胞和其他荧光颗粒物很易很快区别开来。
1.缓冲液/染色的配制
该方法所使用的缓冲液/染液需每天配制。吖啶橙染色液的浓度为0.1%,用2%的甲醛液和四硼酸钠配制成0.02%每升缓冲液。使用前立即以1∶5的比例配成染液和缓冲液的混合液。
2.操作步骤
牛奶加热至40℃左右,以相同体积与染液/缓冲液混合,用一微量注射器吸取1mL样品,放置在76mm×26mm的载玻片上,再用24mm×32mm的盖玻片盖在样品上,使样品在两层玻璃片间均匀散开,用装有合适滤镜的荧光显微镜进行计数,最后结果以每毫升牛奶含有的体细胞数表示。
(三)CMT奶牛乳房炎诊断法
CMT(california mastitis test)是用于临场测定体细胞数的方法。通过CMT获得的信息可用于改善乳房健康管理,保持高质产奶,具有早期、现场、快速等优点。CMT检测步骤如下:
1.样品采集
洗净手后,用乳头浴液和水洗涤乳头,并擦干净;用酒精棉球彻底擦洗乳头孔周围并风干;废弃第1把奶,分别向试验板相应的4个杯中挤4个乳头的奶样,不要使用初乳(产犊3d内)或干奶期奶样;倾斜试验板倒掉多余的奶样,直到每个杯中奶样相等。所剩奶样要同杯中外圈(最大圈)相齐。
2.样品测试
按照包装品说明,稀释浓缩的CMT原液:1瓶浓缩的CMT原液可以配制成5.7L CMT使用液;倾斜试验板至奶样处于内外圈的中间;向每个杯中加入CMT试液,直到液面与杯中的内圈相齐为止。此时奶样和CMT试液量相等,在水平位上轻轻转动混合液。
3.结果读取
1)记录结果
立即观察混合液反应,参照表8-17的标准在所提供的记录板上记录结果。
表8-17 CMT结果
资料来源:谷鸣,《乳品工程师实用技术手册》,中国轻工业出版社,2009年。
2)阳性CMT结果分析
(1)大部分阳性CMT结果表明牛奶中含有非常高的体细胞数:轻微和微弱CMT结果表明可能患有乳房炎,有2种可能。第一,结果说明乳腺感染正在恢复;第二,提示早期乳房炎。不管哪一方面,应再做1次CMT,以确定是否乳房炎存在,并制定相应措施。
(2)明显和很强的阳性CMT结果:表明已经出现炎症,这种炎症可能是由于乳腺机械损伤造成,但最大可能是由于病菌引起的乳房炎,应抓紧制订治疗方案。可使用MAS-TEKTM试剂盒快速帮助选择有效抗生素。
(3)Fossomatic体细胞计数仪测定程序:先把样品加热至40℃(水浴),然后放至样品架上,经搅拌器搅拌均匀后,自动吸取定量的样品0.2mL,并与加热至一定温度的染液和缓冲液混合。混合液进入样品转盘后再被吸取一定的量进行测定,测定结果自动打印出来,打印数乘上1000即为1mL样品的体细胞数。
(四)电子粒子计数体细胞仪法
采用ISO 13366-2:1997《牛奶体细胞测定方法》第2部分电子粒子计数法(见NY/T 800-2004)。在实践中的具体应用参见本节后的附件B。
(五)荧光光电体计数细胞仪法
采用ISO 13366-3:1997《牛奶体细胞测定方法》第3部分荧光光电计数法(见NY/T 800-2004)。在实践中的具体应用参见本节后的附件C。
原有GB 6914-1986《生鲜牛奶收购标准》的修订中增加了体细胞分级标准和检测方法,所用的检测方法遵循NY/T 800-2004。在奶牛场一般使用CMT或者等同于CMT的SMT/BMT来检测个体牛的体细胞,大型牛奶公司则主要使用Fossomatic计数仪进行体细胞的检测。