Ras癌基因家族与血管新生

第三节　Ras癌基因家族与血管新生

Ras癌基因家族是一个在真核生物中高度保守的多基因家族，一般在细胞增殖中起着关键作用。Ras蛋白是一种膜相关的G结合蛋白，分子质量为21ku（P21Ras），含有189个氨基酸残基，参与信号转导，具有鸟嘌呤核苷酸结合活性和内源性GTP酶活性。通常这类蛋白的活性和非活性状态处于动态平衡。处于非活性状态时，P21Ras蛋白结合GDP，在信号转导通路上游另一个蛋白的刺激下，GDP转为GTP，P21Ras构象转为活性形式。已有研究表明，活性P21Ras蛋白通过几种途径调控血管新生。

1．Ras与血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF） VEGF是一种内皮细胞专一性丝裂原和血管新生强烈的刺激因子。在生理或病理状态下血管新生的过程中，VEGF是一个主要调节因子。其主要生物学功能为：①选择性增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖并促进血管形成；②升高血管尤其是微小血管的渗透性，使血浆大分子外渗沉积在血管外的基质中，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养。目前所知的VEGF家族成员包括：VEGF－A、VEGF－B、VEGF－C、VEGF－D、VEGF－E和胎盘生长因子（PIGF）。

研究中表明Ras突变导致VEGF的表达增强。在一些细胞系的研究表明，激活K－ras或转染H－ras导致VEGF－A升高而非VEGF－B或VEGF－C升高；相反通过破坏基因、反义核苷酸或促进相应核酶的表达抑制突变的K－ras，可以抑制VEGF的表达。

在刺激VEGF表达的因子中，研究最清楚的是缺氧诱导因子（HIF－1），HIF－1是一个异源二聚体，它是由120ku的α亚基和91～94ku的β亚基组成。HIF－1α受缺氧诱导，只有在缺氧状态下，细胞中的HIF－1α才能稳定表达。通常HIF－1α与VHL（Von Hippel Lindau，VHL）肿瘤抑制蛋白结合，并且不断被水解。这是因为在常氧状态下，HIF－1α羟化酶使HIF－1α的ODD（氧依赖降解区）发生羟基化，羟基化作用使与VHL结合，导致蛋白酶降解HIF－1α；但在缺氧条件下羟化酶不能发挥作用，HIF－1α不能被VHL识别，导致其在细胞中堆积并激活转录。现有研究表明，Ras蛋白具有不同的两种信号级联通路Ras＞Raf＞MEK＞ERK1／2和Ras＞PI（3）K＞PDK＞PKB，参与调节VEGF的表达。ERK1／2可以直接磷酸化HIF－1α，导致反式激活和增强VEGF启动子，促进VEGF的表达。另外，Ras也与缺氧诱导的HIF－1α蛋白的稳定性有关。在成纤维细胞中激活Ras，可以检测到HIF－1α稳定性增强，这可能与PI（3）激酶调节的HIF－1α的降解有关。

除了HIF－1α外，Ras蛋白还可以通过影响其他的转录因子调节VEGF启动子的活性。在VEGF mRNA启动子上有一个关键的元件，位于－88／－50，是一个GC富集区，能与SP1、SP3和AP2结合。激活任何一个Ras蛋白，都可以通过SP1／AP2结合位点增强VEGF的启动子。这可能与Ras＞Raf＞MEK＞ERK1／2信号通路有关，ERK1／2磷酸化SP1，增加其与DNA结合的能力。

VEGF的表达除了与转录有关外，还与其mRNA的半衰期有关，细胞质中的一些蛋白与其mRNA的3′UTR，调节其半衰期。一些应激蛋白［如Jun－kinase（JNK）］可以调节这些蛋白。原癌基因Ras可以通过Ras＞Rac＞MEKK1＞JNKK＞JNK调节一些激酶。当H－ras激活时，VEGF mRNA的稳定性增加3～5倍，但是否通过上述途径尚无直接研究。

在mRNA翻译的过程中需要eIF－4E（一种翻译起始因子），其作用被一种蛋白4E－BP1（4E－binding protein 1）抑制。磷酸化4E－BP1可增强eIF－4E的功能。在一些细胞研究中表明，VEGF高表达与eIF－4E高表达具有一致性。并且有研究表明两个信号通路PI（3）K＞PDK＞PKB＞FRAP和Raf＞MEK＞ERK1／2增加4E－BP1的磷酸化，这两个信号通路都受Ras调节。但Ras通过这两个信号通路对VEGF mRNA翻译的影响尚无直接研究报道。

上述研究均为激活后的Ras蛋白刺激VEGF的表达，但还有研究表明，缺氧也可诱导未突变的Ras（wt ras）表达。这引出了两个问题：缺氧诱导Ras表达的机制是什么？另外Ras表达有助于缺氧诱导的VEGF表达吗？

缺氧诱导活性氧离子（ROS）和一氧化氮离子（NOS）合成。这些离子可以促进Ras合成，尤其是NOS。NOS由一氧化氮合酶（iNOS）合成。iNOS也是缺氧时HIF－1的反应基因。这样iNOS可能通过直接激活Ras促进缺氧诱导的VEGF表达，但iNOS也可以通过其cGMP抑制VEGF的合成。另外一个信号通路是通过酪氨酸激酶或者G蛋白信号通路。缺氧激活酪氨酸激酶c－Src，然后磷酸化Shc（c－Src的一个底物），最后激活Ras和ERK1／2。这个信号通路与激活G蛋白相似。

缺氧时诱导wt－ras有助于VEGF合成吗？研究表明Ras通过其信号通路激活转录因子SP1／3，这是VEGF合成必需的；另外抑制Ras能抑制缺氧诱导的VEGF表达。这样，Ras激活可能是VEGF合成必需的（图6－1）。

2．Ras与血栓素（thrombospondin，TSP） TSP最早是从培养细胞的上清液中分离出的一种新生血管抑制因子，从肿瘤实验动物模型的血清中也可分离出，包括TSP－1和TSP－2。实验表明TSP可以与细胞外基质中的一些成分，如蛋白酶和生长因子结合，能够阻断血管生长因子诱导的毛细血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，同时能加强平滑肌细胞对PDGF所引起的增殖和迁移反应。激活Ras的任何一个成员（H－ras、K－ras以及N－ras）都可以抑制TSP的表达。Ras蛋白参与的信号通路（Ras＞Rac＞MEKK1＞JNKK＞JNK），通过激活JNK磷酸化转录因子c－Jun，抑制TSP－1的表达；另外还有研究表明单独激活的c－Jun就像激活Ras一样，抑制TSP－1的表达。

3．Ras与环氧化酶（COX） COX是前列腺素（PGs）合成过程中重要的限速酶，它催化花生四烯酸转化为内源性过氧化物PGH2。它有两种同工酶：COX－1和COX－2。COX－2对肿瘤的作用一方面是因为在催化合成前列腺素的反应中，消耗了有促进细胞凋亡作用的花生四烯酸；另一方面则是因为合成的前列腺素增加可引起VEGF表达的上调而刺激血管的生成，这个过程可能通过PG－E2和其受体EP2、EP3的信号通路完成，但一些研究提示这个过程参与Ras诱导的血管新生过程。

具体研究表明，有几个信号通路促进COX－2表达。①Wnt信号通路；②缺少p53的表达；③HER－2／neu信号通路；④缺氧；⑤Ras和Src信号通路。

Ras通过几个不同的信号转导途径调节COX－2基因的表达。首先通过Ras＞Rac＞MEKK1＞JNKK＞JNK信号通路磷酸化c－Jun，通过cAMP反应元件刺激COX－2转录。另外激活H－ras后，其经典的信号通路Ras＞Raf＞MEK＞ERK1／2也是上调COX－2表达必需的，这可能通过磷酸化CCAAT／增强子结合蛋白β（C／EBPβ）和（或）通过Ets转录因子PEA3促进COX－2表达。

另外在肠上皮细胞研究中发现，激活K－ras2，增强COX－2mRNA的3′UTR的稳定性，促进其表达。这个过程可能与Ras＞Raf＞MEK＞ERK1／2和Ras＞PI（3）K＞PDK＞PKB信号通路有关。后一个信号通路控制cap依赖的mRNA翻译。但Ras是否对于COX－2mRNA和VEGF mRNA翻译起始有同样的作用尚不可知。

一些研究表明：抑制APC能调节Wnt信号通路，进而增强转录因子TCF的功能，这个转录因子可与COX－2启动子的TCF结合元件结合，促进COX－2的转录。另外激活Wnt信号通路能上调PEA3，进而促进COX－2的转录。这些研究表明：Wnt和Ras信号通路共同调节COX－2的表达（图6－2）。

4．Ras与蛋白酶 Ras激活后导致细胞外基质中蛋白酶表达增加（包括尿激酶纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator，uPA），基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases，MMP）。uPA与其受体结合后降解正常血管基膜成分，还可以起介导MMP的作用，并刺激上皮细胞增生和迁移。这对血管新生的开始是很重要的。激活Ras后有几个不同的信号通路刺激uPA表达。首先：Ets转录因子（Ras＞Raf＞MEK＞ERK1／2的底物）和c－Jun（Ras＞Rac＞MEKK1＞JNKK＞JNK的底物）在－1967位点与PEA3（Ets转录因子）或AP1（转录因子结合蛋白1transcription factor activator protein 1，AP1）结合元件结合；另外激活Ras后活化MAPK和JNK，增强GTPase Ral的鸟苷酸交换因子，促进uPA的表达。

另外，H－ras通过PEA3和AP1结合位点调控MMP－9启动子的活性，促进其表达。促进uPA和MMP的表达对血管新生没有直接的作用，但可以通过降解ECM，促进生长因子VEGF或bFGF到达血管内皮细胞，增强这些因子的活性。

综上所述，Ras蛋白通过三个方面影响血管新生（图6－3）：①刺激促进血管新生的生长因子；②减少抗血管新生的抑制因子；③保证生长因子到达局部细胞外基质。