角膜囊袋法诱生的角膜新生血管模型

兔角膜囊袋法是研究新生血管最常采用的方式之一。常采用的诱导剂有内毒素、VEGF、二氧化硅等。下面以缓释内毒素和bFGF缓释药丸诱生角膜新生血管动物模型的制作为例，作具体介绍。

1．缓释内毒素聚合物药丸诱生角膜新生血管模型

（1）缓释内毒素聚合物药丸的制备：乙烯－醋酸－乙烯脂聚合物（Elvax）珠采用高纯的乙醛清洗至分光光度纯，在室温下将聚合物溶于二氯甲烷至10%（W／V）最终浓度，将一定比例E．Coli内毒素与10%Elvax混合并强力搅拌至均匀悬液。内毒素药丸的计算公式：所需内毒素百分比＝x／（0．1＋x），x＝毫克内毒素／毫升聚合物，内毒素－Elvax悬液用消毒滴管滴入8孔玻璃板聚合，完全聚合后，制成1mm3大小、每丸1．3±0．3mg，紫外线消毒后－40℃储藏备用。

（2）角膜囊袋制作：所有手术步骤均在无菌条件下进行，3%戊巴比妥钠兔耳缘静脉注射全身麻醉（25mg／kg），1%丁卡因局部点眼麻醉，在角膜中央做1．5mm、1／2角膜厚度切口，向6点位潜行分离1／2厚角膜囊袋，至距角膜缘2．0mm处，采用玻璃套管植入制备好的缓释药丸，将囊袋切口重新复位，以便愈合。角膜新生血管与局部内毒素呈量效依赖关系。用浓度为15%内毒素聚合物能获得显著的角膜新生血管生长，仅伴有轻微的角膜水肿，能诱生适宜的角膜新生血管动物模型。内毒素浓度过高则引起显著的角膜炎症，基质浑浊而且新生血管生长易融合，影响新生血管测量和计算的准确性，浓度太低则诱导力度过小，不适合模型的要求。

内毒素诱生的角膜新生血管继发于炎症反应，并且炎症刺激反应与新生血管的诱生呈正相关，内毒素诱生新生血管过程可能受巨噬细胞分泌的bFGF因子调控，并且被巨噬细胞分泌的其他因子如肿瘤坏死因子－2α和转化生长因子－2β放大。当然，炎症反应并不是新生血管诱生的先决条件，像bFGF、VEGF等缓释聚合物诱生的则是非炎症性角膜新生血管。

该模型与角膜基质肿瘤植入术、热烙术、物理化学灼伤诱生的角膜新生血管模型相比较，其最大的优点是：新生血管定向成束生长，重复稳定，测定和定量分析的准确性明显提高，并且可采用计算机图像分析系统进行每日连续动态定量测定，方便与对照组比较。缺点：操作复杂、影响因素多、手术创伤本身即可引起角膜新生血管形成。

2．生长因子（bFGF、VEGF等）缓释药丸诱生的角膜新生血管动物模型 下面以bFGF缓释药丸为例说明角膜新生血管动物模型制作方法：bFGF缓释药丸由缓释剂聚甲基丙烯酸－2－羟乙酯（hydron）和一定量的诱导剂bFGF混合而成，在bFGF－hydron缓释药丸中加入一定量的硫糖铝（sucralfate），制成hydron包裹的bFGF－sucralfate缓释药丸，可有效地稳定bFGF的生物活性，减缓bFGF的释放。角膜囊袋按常规方法制作。

bFGF是包含146个氨基酸具有复杂功能的单链肽，在一系列体外实验中，被证实具有对血管内皮细胞分化、增殖、迁移和趋化作用。Montesano等的体外实验表明：bFGF诱导的微血管内皮细胞可产生大量的u－PA，在血管生成早期起中心作用，u－PA将纤维蛋白溶酶原转化成具有酶活性的纤维蛋白溶酶，后者又可激活胶原酶，溶解新生血管起始缘的基膜，并导致内皮细胞进入三维的胶原基质，形成新的毛细血管芽。

该模型的优点在于：bFGF作为新生血管的直接刺激因子，可排除炎症等间接新生血管刺激因素，这对于特定的新生血管抑制剂的疗效评价有重要意义。便于定量分析，稳定性和重复性俱佳且经济实用。