转基因小鼠技术

1．显微注射法 显微注射法是目前最常用的转基因方法，该方法是利用显微操作仪将外源基因注射到受精卵前核，待其发育成桑葚胚或囊胚后移入假孕母鼠的输卵管，受精卵运行到母鼠子宫，发育成熟致分娩，即可获得转基因小鼠。该方法所转基因长度可达250kb，转基因小鼠阳性整合率为1%～10%，但重复性较差。

2．精子载体法 精子载体法是Lavitrano等首先报道的，主要技术是将外源基因与活精子共同孵育，通过精子摄取外源基因，体外受精，获得小鼠。该方法可获得30%的阳性整合率。Perry等改良了此方法，他们通过去垢剂或冻融破坏小鼠精子的膜，然后将外源基因与精子共同孵育，使基因结合到精子表面，然后将该精子注射入未受精的小鼠卵母细胞内，从而产生携带有该基因的子代小鼠品系。该方法可获得20%左右表达外源基因的小鼠。该方法与显微注射法相比，有很多优势。它是将带基因的精子注射到卵母细胞的胞质，而不是原核，因此降低了操作难度，这将有利于大片段DNA的操作。

3．体细胞克隆法 体细胞克隆法是将外源基因在体外转染体细胞，经过筛选后获得稳定携带外源基因的体细胞，然后将该体细胞注射入去核的卵母细胞，经融合、激活后发育至囊胚并移殖入同步假孕动物，即可获得携带外源基因的子代动物。利用体细胞克隆法的优点在于外源基因的整合率可达100%。但在技术上存在相当的难度，胚胎病死率高，成功率低。

4．反转录病毒法 该方法的原理是，反转录病毒感染细胞后，其RNA反转录为DNA前病毒，依赖整合酶及其末端特异性核酸序列，DNA前病毒可以整合到染色体上。Chan等改良了这一方法，他们将携带外源基因的反转录病毒注入处于MⅡ期的卵子的透明带，然后将这些卵子体外受精，待受精卵发育为桑葚胚后移植入假孕动物。该方法可以使56%的受精卵携带外源基因，整合阳性率是显微注射法无法比拟的，而且避免了嵌合体动物的产生，且操作相对简单。因此，具有较好的应用前景。但该方法存在较大的缺陷，如反转录病毒载体携带外源基因DNA的长度一般不能超过10kb；反转录病毒载体上的一些固有序列有可能激活宿主瘤基因的表达，造成表达紊乱；此外，反转录病毒载体一般发生多位点整合，因此子代动物的遗传性状差异较大，不利于外源基因功能的分析。Carlos等利用体外重组的慢病毒载体，通过广泛表达的启动子，携带绿色荧光蛋白基因，产生转基因小鼠。80%的首建鼠至少有一种整合阳性。子代小鼠显示携带绿色荧光蛋白基因。