病毒分离培养技术
病毒缺乏完整的酶系统、无核糖体等细胞器，因此必须借助宿主细胞的酶系统与细胞器才能生长和繁殖。病毒是严格的细胞内寄生微生物。病毒分离培养一般需要接种实验动物、鸡胚、体外培养的器官或细胞。
（一）样品的采集与处理
样品采集得正确与否，直接影响病毒的分离结果。用于病毒分离的组织样品要含有足够量的活病毒，一般根据病毒的生物学活性、病毒感染的特征、流行病学规律及抗体免疫保护机理，选择所需要样品的种类及样品保存处理的方法。
（二）实验动物培养
实验动物培养法分离病毒是一种最常用的方法，实验动物培养病毒的优点主要包括可以培养目前无法用细胞、鸡胚培养的病毒，如兔瘟病毒、绵羊痒病病原等；无需复杂仪器设备，技术简单，容易取得成功。但是利用动物进行病毒分离培养对动物要求高，同时由于动物个体间差异较大，结果判定比较困难，成本较高，且容易造成环境污染及携带病毒等，所以自从细胞培养广泛应用以后，很少再用实验动物培养病毒。尽管如此，病毒的动物培养仍然是病毒学实验中常用的技术。用实验动物进行病毒培养，要在符合分离病原生物安全要求的动物实验室中进行。
1.实验动物选择
首先要选择对目的病毒最敏感的实验动物品种或品系。如果病毒对宿主的选择性强，则要选择自然宿主；如果病毒对宿主的选择性不强，可用实验室常用的小动物。另外还要求动物健康，体重、年龄及营养状况等要一致。最好选用遗传特性相似、个体差异较小、生物学反应比较一致的动物。
用于病毒分离的大动物应来自非疫区，而且是未接种过相应病毒疫苗、青壮年以及临床检查和检疫健康的动物。小鼠、大鼠、鸡等应使用SPF级动物。
2.实验动物接种
接种部位首先要通过剪毛、拔毛、剃毛或化学脱毛等方法除毛，之后用碘酊、75%乙醇对接种部位消毒。常见动物接种方法如下。
（1）划痕法
此法常用于家兔。用剪毛剪剪去兔肋腹部长毛，再用剃刀或脱毛剂脱去长毛。以75%乙醇消毒后，用无菌手术刀在其皮肤上划几条平行线，划痕口可略见出血，然后将接种物涂在划痕口上。
（2）皮下接种
将动物局部皮肤用75%乙醇消毒后提起，注射器针头斜向刺入皮下，缓缓注入接种材料。注射完毕，在针头处按一酒精棉球，然后拔出针头，以防接种物外溢。小鼠常选背部、腹股沟部或尾根部皮下，家兔、豚鼠及大白鼠常选腹股沟部、背部或腹壁中线皮下，禽类（鸡、鸭）常选颈部、大腿内侧、胸部皮下等。接种量一般是小鼠0.2～0.5 mL，豚鼠、家兔、大鼠0.5～2.0 mL，鸡、鸭0.5～1.0 mL。
（3）皮内接种
常以家兔、豚鼠背部或腹部皮肤为注射部位。去毛消毒后，将皮肤绷紧，用1 mL 注射器的4 号针头，平刺入皮肤，针尖向上，缓缓注入接种物，皮肤出现小圆形隆起。注射量一般为0.1～0.2 mL。
（4）肌内接种
一般选动物的腿部或臀部，禽类以胸侧肌肉为宜。去毛消毒后，将针头刺入深部肌肉内，注射量视动物大小而定。
（5）腹腔内接种
大鼠、豚鼠、小鼠腹腔内接种宜采用仰卧保定法。接种时稍抬高后躯，使其内脏倾向前腔，在股后侧面插入针头，先刺入皮下，后进入腹腔，注射时应无阻力，皮肤也无隆起。注射量为家兔10 mL，大鼠、豚鼠5 mL，小鼠0.5～1 mL。
（6）静脉注射
①家兔耳缘静脉注射。
保定家兔后选一侧耳缘静脉，用75%乙醇涂擦兔耳，或用手指轻弹耳朵，使静脉怒张。注射时用左手拇指和食指拉紧兔耳，右手持注射器，使针头与静脉平行，向心脏方向刺入静脉内，注射时无阻力且有血向前流动表示进入静脉，缓缓注射接种物。注射完毕后用消毒棉球压紧针孔，以免流血或注射物外溢。
于豚鼠尾侧静脉注射。
俯卧保定豚鼠，使其腹面向下，后肢剃毛，用75%乙醇消毒皮肤，全身麻醉后，用锐利刀片从后肢内侧从上向外下方切1 个长约1 cm 的切口，露出尾部，用4 号针头刺入尾侧静脉，缓缓注入感染材料。接种完毕将切口缝合1～2 针。
③小鼠尾侧静脉接种。
选用15～20 g 体重小鼠，注射前将小鼠尾部浸于约50℃的温水中1～2 min，使尾部血管扩张。用1 个烧杯扣住小鼠，露出尾巴，用4 号针头刺入尾侧静脉，缓缓注射接种物。注射时无阻力，皮肤不变白、不隆起，表示注入静脉内。
④脑内接种法。
注射部位常选用动物耳根部与眼内角连线的中点。小鼠接种时，先对其额部消毒，用左手食指和拇指抓住两耳和头皮，用4 号针头注射器垂直刺入注射部位，以针尖斜面刚穿过颅骨为限，缓缓注入。注射完毕拔出针头的同时，应将注射部位的皮肤稍向一边推动，以防液体外溢。家兔和豚鼠因颅骨较硬，需要用钢针在接种部位打孔后再注射，且需用乙醚进行麻醉。脑内接种的最大注射量为家兔0.2 mL、豚鼠0.15 mL、小鼠0.03 mL。脑内接种后1 h内出现神经症状的动物应弃去，这种情况多因接种创伤所致。
⑤鼻内接种法。
先将动物轻度麻醉后，用注射器针头将接种材料滴入鼻内，随着动物吸气，将接种物吸入呼吸道内。必须掌握好麻醉深度。麻醉过深，接种物不易被吸到呼吸道内；麻醉过浅，接种物易被喷出。滴入的接种物不宜过浓，否则容易引起动物死亡。小鼠滴入量为0.03～0.05 mL，家兔和豚鼠可适当增加。
2.实验动物临床观察
实验动物接种后，通常以发病、死亡作为感染指标。根据不同的试验目的，观察记录接种动物的精神状态、体重、食欲、体温、症状表现等情况。
3.病毒的收获
病毒感染动物材料的收获必须进行严格的无菌操作。收获的材料通常包括病毒血症期的血液以及病毒的靶器官。所有收集的材料置-70℃条件下储存备用。
（三）鸡胚培养
鸡胚培养是较早应用的病毒分离培养方法。鸡胚（含其他禽胚）是正在发育的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛。采用鸡胚培养具有诸多优点，可选择不同日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和体液中含有大量的病毒，容易采集和处理，原料来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，对接种的病毒不产生抗体等。因此鸡胚培养常用于多种病毒的分离培养、生物学特性鉴定、弱毒株培育、疫苗制备、卵黄抗体生产及药物筛选等。目前，在禽流感病毒、副流感及其他病毒病的研究方面，鸡胚（含其他禽胚）仍具有重要的应用价值。
但是鸡胚培养也有缺点。胚内可能污染细菌（如沙门氏菌）和病毒，尤其是经母鸡垂直传播的病毒，如禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性贫血病毒、劳斯肉瘤病毒等。胚胎中往往含有因母鸡免疫而产生的卵黄抗体，影响同种病毒的增殖，所以应选用SPF 鸡群产的卵。一般孵育8～14 d 的鸡胚还未长出羽毛，且整体发育日趋完善，各种脏器均已形成，胚体对外源接种物的接受性较强，利于病毒的增殖。14日龄以后，鸡胚骨骼逐渐硬化，体表羽毛渐生，不利于病毒的感染。
1.鸡胚的选择与孵育
将SPF 鸡蛋置于37℃孵化箱或恒温箱中培养，相对湿度45%～60%。孵育3 d 后，每天翻蛋2～3 次，以保证气体交换均匀，鸡胚发育正常。孵育后第四天起，用照蛋灯对鸡胚进行检查。发育良好的鸡胚血管明显可见，胚体可以活动；未受精鸡蛋无血管；死亡鸡胚血管消散，呈暗色且胚体固定不动。应及时弃去未受精蛋与死亡鸡胚。实验室接种用的鸡胚最小6日龄，最大不超过11日龄，一般多用9～10日龄接种。
2.接种前的准备
用铅笔标出气室位置，并在气室底边胚体对侧或附近无大血管处标出接种部位。若卵黄囊接种或绒毛尿囊膜注射，还要画出相应部位，另外还要用碘酊和75%乙醇棉球消毒准备接种部位的蛋壳表面。
3.鸡胚接种法
（1）绒毛尿囊膜接种
主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖，这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑或病斑。用10～12日龄鸡胚，在胚胎附近略近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙出1 个直径3～4 mm 的烤焦圈，用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗，但不可损伤壳膜。在气室端中央钻1 个小孔。随后用针尖轻轻挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。滴1 滴灭菌生理盐水于刺破处。用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴加于壳膜上的生理盐水迅速渗入。用1 mL 注射器滴2～3 滴接种物于绒毛尿囊膜上。最后用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗上，周围涂熔化的石蜡密封。气室中央的小孔可用石蜡密封。鸡胚在接种后，横卧于孵化箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（2）绒毛尿囊腔接种
主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如流感病毒和新城疫病毒的分离与增殖，也是制备马脑炎病毒疫苗的常用接种途径。选用10～11日龄的鸡胚，画出气室和胚位，在气室接近胚位处涂抹碘酊和酒精消毒后，用钢锥穿1 个小孔，随后将注射器针头沿此小孔插入0.5～10 cm 处（避开血管），注入0.1～0.2 mL 接种物。最后用石蜡封口，气室朝上，并置于孵化箱中孵育。每天翻卵并检卵1 次。24 h 内死亡者废弃。
（3）卵黄囊接种
主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离与增殖。用6～8日龄鸡胚，画出气室和胚胎位置后，垂直放置在固定卵座上，用碘酊和酒精消毒气室端，用钢锥在气室中央锥1 个小孔，用灭菌注射器吸取含病毒的悬液，沿气室端的小孔刺入约3 cm，注入0.1～0.5 mL 接种物于卵黄囊内。随后用溶化的石蜡封孔，置于孵化箱内继续孵育。每天翻卵1～2 次。24 h内死亡者废弃。
（4）羊膜腔接种
主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖。病料初次分离病毒时，羊膜腔接种法比尿囊腔接种法敏感。但此法操作技术比较困难，鸡胚也易受伤致死。选用11～12日龄的鸡胚，按绒毛尿囊膜接种法造成人工气室，撕去卵壳，并刺破绒毛尿囊膜血管较少的部位，用钝端镊子沿此破孔插入，夹起羊膜囊，注入0.1～0.2 mL 接种物。由于不易判断接种物是否被正确地注入羊膜腔内，故可将吸取了接种物的注射器的筒栓稍微回抽，使注射针芯内含1 个气泡。注射时将气泡和接种物一起注入。将卵适当倒转，即可清楚地看到气泡是否在羊膜腔内，以判定注射是否正确。用石蜡封闭接种口后，将鸡胚直立孵化，气室向上。
4.接种后的检查
接种病毒后的鸡胚一般放在37℃条件下孵育，每天检查1～2 次。除接种东方型和西方型马脑炎病毒等外，接种后24 h 内死亡的鸡胚多数是由于鸡胚受损或污染细菌所致，应弃去。
病毒在鸡胚中增殖，除部分病毒产生痘斑、充血及出血、胚胎小、卷曲状、爪畸形或死亡等变化外，许多病毒缺乏特异性感染指征，必须应用血清学反应或检查病毒抗原以确定病毒存在。
5.鸡胚的收获
收获前将鸡胚置于4℃条件下放置6 h 或过夜，冻死胚胎，防止出血，先用碘酊，后用乙醇消毒气室部蛋壳，去除蛋壳和壳膜。羊膜腔接种者，撕破绒毛尿囊膜而不损伤羊膜。用灭菌镊子轻轻按住胚胎，以灭菌吸管或注射器吸取尿囊液，装入灭菌容器内，多时1 枚鸡蛋胚可收取5～8 mL 尿囊液。收集的液体应清亮。若浑浊，多表示有细菌污染，需做菌检。如有少量血液混入，可1 500 r/m 离心10 min，重新收获上清液。绒毛尿囊膜接种者，收获接种部位绒毛尿囊膜并注意观察病变。羊膜腔接种者，应先按照上述方法收集完尿囊液，再用注射器插入羊膜腔内收集羊水，一般1 枚鸡胚可收取约1 mL。卵黄囊接种者，应先收集完尿囊液与羊水，再用吸管收集卵黄液。所有收集的材料经无菌检查后置于-70℃条件下贮存备用。
（四）组织培养
1.组织培养的定义
组织培养最早是指从动物或植物机体中取出组织，模拟体内的生理环境，使之在体外生存、生长，并维持其结构和功能的方法。现在则泛指体外的组织、器官和细胞培养，广泛应用于病毒分离培养及进行病毒学试验研究。组织培养技术20 世纪50年代传入我国，经20 世纪70年代的发展，我国学者在动物细胞工程领域也作出了卓越贡献，包括鱼类核质重组及体细胞克隆等。我国已将亲缘关系远近不同的鱼类进行核质重组，在变种间、属间及科间都获得了性状独特的核质重组鱼，并且通过体细胞克隆，成功克隆出了山羊和牛。
2.组织块的培养
细胞培养或组织培养用动物胎儿、器官或组织，在无菌条件下采集后应尽快培养，如需保存1～2 d，可将其切成0.5 cm3 小块浸泡于营养液内，加抗生素后，4℃冰箱保存；如欲保存1～2 周，应将组织切成1～3 mm3 的小块，Hank’s 液冲洗2～3 遍后，加入5～10 倍量营养液（含抗生素），置于优质玻璃瓶中盖上胶塞后4℃冰箱保存，但在培养前还需用洗液将其冲洗2～3 遍；如需运送，可将带有营养液的组织块置于0～4℃冰箱中运输。
组织块培养是原本意义上的组织培养，是指取动物组织切成小块后在固定或悬浮状态下的培养，是应用最早的组织培养法，分为固定培养和悬浮培养2 种方法。组织块固定培养法是将组织剪成1 mm3 小块，Hank’s 液冲洗2～3 遍后用弯头吸管吸取20～30 块，以间距0.5 cm 均匀放入25 mL 培养瓶内。轻轻将培养瓶翻转，组织块粘附在瓶底朝上，向瓶中加入适量培养液但不接触组织块。在前2 d，每天将培养瓶小心翻转2～4 次，以湿润组织块。当镜检发现细胞由组织块周围呈放射状增殖后，可使培养液浸泡组织块，继续培养和换液接种病毒。组织块悬浮培养法是先制备组织块。按每毫升培养液加入10～15 块组织的比例于培养瓶中培养，例如猪传染性胃肠炎病毒即可进行猪胎小肠组织块悬浮培养。
3.细胞培养
（1）细胞培养的定义、特点与应用
细胞培养是指采用酶消化、机械或化学方法将组织分散成单个细胞后，选用最佳生存条件对活细胞进行培养与研究的技术。它是20 世纪50年代利用组织细胞分散技术发展起来的。细胞培养研究病毒具有许多优点，无个体差异，重复性好，无免疫力和隐性感染干扰，敏感细胞易于获得，成本低廉；病毒分离过程迅速，培养条件易于控制，感染结果易于判定；可利用蚀斑技术进行病毒纯化与定量；可批量化接种，能够提高病毒的产量与质量等。细胞培养在病毒学研究中得到了广泛应用，主要表现在病毒的分离与鉴定；研究病毒的繁殖过程及其在不同细胞中的敏感性与传染性（细胞的病理变化及包涵体的形成）；观察病毒传染时细胞新陈代谢的改变，探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制，以及研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性；生产特异性诊断抗原、病毒疫苗、干扰素等；病毒性疾病的诊断和流行病学调查；繁殖病毒载体，以用于基因治疗等。细胞培养的缺点是细胞培养病毒的试验是在离体情况下进行的，病毒感染细胞不受机体代谢、调节及免疫机制控制，故试验结果不能反映整体水平，要辅以动物实验等。
（2）细胞培养的基本要求
体外培养细胞缺乏抗感染能力，要严格无菌操作，防止污染是决定培养成功与否的首要条件。培养所用的一切物品、液体均应无菌，一切操作均应最大可能地保持无菌。试验前要制定好实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好，根据试验要求，准备好所需的各种器材和物品，清点无误后将其放在操作现场（无菌间、超净台），然后开始消毒。培养液等需37℃预热。实验器材准备数要大于实际使用数，细胞培养瓶瓶盖数要大于瓶数，这样可避免操作时因物品不全而不得不再次拿取，以降低污染的机会。使用无菌间操作区和超净台前后，需用紫外线灯照射消毒20～30 min，所有进入操作区域的物品需经75%乙醇擦拭消毒。工作前后台面均需用75%乙醇擦拭消毒，特别是有液体溢出时需立即擦拭。平时无菌间每天都要用0.2%新洁尔灭或2%～5%来苏儿拖洗地面1 次（拖布要专用），紫外线照射消毒超净工作台30～50 min，超净台常用消毒水擦拭。细胞间的洗手和着装原则上与外科手术要求相同，进入无菌间可更换专用无菌服，戴口罩和帽子，而且每次试验后，无菌服、口罩和帽子都要清洗消毒。双手戴乳胶手套，或用肥皂洗净后浸泡于消毒液中，然后用75%乙醇或0.2%新洁尔灭消毒。试验过程中手可能触及污染的制品，出入实验室都要重新用消毒液洗手。
试验中必须保证无菌操作。试验前要点燃酒精灯，一切操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需要在火焰附近，烧灼消毒管口或瓶口后再进行。但要注意金属器械不能在火焰中长时间灼烧，烧过的器械要冷却后才能使用。已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，防止将残留的培养液烧焦后形成的有害物质带入培养基中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞。胶塞过火焰时不能时间过长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。工作台面上的物品要放置有序、布局合理。酒精灯放中间，左手使用物品放在左侧，右手使用物品放在右侧。组织、细胞及培养板未做处理和使用前，不要过早暴露于空气中。应分别使用不同吸管吸取不同液体及处理不同细胞。用吸管与移液器转移液体时，不能触及瓶口。培养瓶、培养液瓶不要过早打开，已开口者要尽量避免垂直放置，以防止下落细菌的污染。放置吸管时管口向下倾斜，以防液体倒流引起污染。
操作时动作要稳、准，尽量缩短各种液体、细胞暴露的时间，动作幅度尽可能小。不要面向操作台讲话或咳嗽，避免唾沫把微生物带入超净工作台内发生污染。离开超净台时，立即关闭侧窗口，避免无菌室内微生物随空气流入净化操作区。试验完毕，整理清扫台面，用过的玻璃器材投入清水中浸泡，用酒精棉纱或棉球擦拭工作台面，关闭超净台风机和电源。
（3）细胞培养的类型
根据细胞的来源、染色体特征及传代次数，分为3 种类型：原代细胞培养、二倍体细胞培养及传代细胞培养。
①原代细胞培养。
原代细胞是指从活动物中取组织，在无菌条件下经胰酶等分散剂的作用，消化成单个细胞，加培养液在培养瓶贴壁生长或悬浮生长（如淋巴细胞）的细胞。大多数组织均可制备原代细胞，但生长快慢及难易程度不同。肾与睾丸最为常用，甲状腺细胞生长较慢，只用于某些特定病毒，如猪传染性胃肠炎病毒的培养。原代细胞来源于易感动物的细胞，故对病毒的易感性高，主要作为病料中的病毒初代分离。其缺点是每次培养细胞必须要用相应的活组织，因此其来源受限制，成本较高，且易存在隐性感染的病毒，最好选用SPF 动物的组织。
A.鸡胚原代成纤维细胞培养。
无菌条件下取9～11日龄SPF 鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，75%酒精棉消毒蛋壳气室部位。用镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位的卵壳。用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜，钩住鸡胚头部，移入灭菌的平皿内。用剪刀剪去胚头、四肢及内脏，用Hank’s 液洗去体表血液，移入灭菌小烧杯中。用灭菌剪将胚体剪碎至1 mm3 小碎块。加入Hank’s 液（淹没组织碎块即可），轻摇，静置1～2 min，待组织块下沉，吸去上层悬液。重复2～3 次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混浊为止，移入灭菌的小三角瓶中，吸去Hank’s 液。取出预热好的0.25%胰酶，向三角瓶中加入约8 mL。包紧瓶口，37℃条件下消化30 min，每隔5 min 轻轻摇动1 次。由于胰酶的作用，鸡胚细胞与细胞间的氨基和羧基游离。待液体变混而稍稠，轻摇可见组织块，悬浮在液体内不易下沉，此时可中止消化。如再继续消化，会破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加5 mL 含血清的DMEM 生长液，以吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见生长液混浊，即为细胞悬液。静置1 min 后，使未冲散的组织块下沉。用4 层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。用细胞计数器计数，根据计数结果，加入DMEM 生长液，调整细胞浓度至50 万～60 万个/mL。在培养瓶中加入2 mL DMEM 生长液（如果是50 mL 的培养瓶，加4 mL 生长液），小心吸出过滤后的细胞悬液0.25 mL 放至培养瓶中（如果是50 mL 的培养瓶，加0.5 mL 细胞悬液），吹打均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日期，置37℃温箱中培养。4 h 后细胞即可贴壁，24～36 h 生长成单层细胞，此时可更换培养液，并接种病毒。
B.仓鼠肾原代细胞。
取10～14日龄的幼仓鼠，剪断其颈动脉放血至死。在颈胸交界处全周剪开皮肤，朝尾部方向撕下整个鼠皮，直接用自来水冲洗干净后，置于清洁搪瓷盘内送无菌室。先后用碘酊及75%乙醇消毒，用剪刀沿背中线剪开，并向四肢延展。更换镊子及剪刀，将皮肤撕向两侧，露出背部。再换剪刀，于肋骨后剪1 个长约1 cm 的切口，将镊子插入切口夹住肾脏，剪断粘连后将肾移入灭菌平皿内。按同样方法取出另一侧肾。随后在平皿内剪除肾脏上的脂肪，剥去肾包膜，将肾平剪成两半，剪除肾盂部分，用Hank’s 液清洗后移入广口瓶中剪碎，洗涤后加入0.25%胰酶于37℃水浴中消化。
C.原代白细胞。
白细胞的分离方法根据不同动物的血沉快慢而不同。对血沉快的马属动物，颈静脉采血后加入已含有肝素溶液，放入预冷的采血瓶内，尽快置于4℃冰箱静置30～40 min，用吸管小心吸弃上层血浆，置离心管中加Hank’s液混合均匀后，1 000 r/m 离心10min，弃上清液，加少许洗液悬起细胞，加满瓶，再离心，弃上清液，加牛血清，用吸管吹打混匀后进行细胞计数。最后稀释为1～2×107 个/mL，装瓶培养，1～2 d 细胞长成单层，此时可更换液，同时接种病毒。
对猪、牛等血沉缓慢的动物，要采用特殊的白细胞分离技术，即在肝素抗凝血后，立即加入等量的犊牛血清或1.5 倍量的6%葡聚糖PBS 溶液，4℃冰箱静置1 h，吸弃上层血浆，再如上文收集白细胞、洗涤和培养，其中葡聚糖溶液的浓度和加入量可通过预试验而具体调整。
于二倍体细胞株的培养。
二倍体细胞株是指将长成单层的原代细胞消化、分散成单个细胞，继续培养传代。其染色体与原代细胞一样，保持其二倍体细胞数目的细胞。优点是细胞碎片少、均匀，潜伏病毒易发现，对病毒的敏感性与原代细胞相似，且细胞数量可扩大，容易得到。但二倍体细胞在体外不能无限制连续传代，传到一定代次，细胞会逐渐衰老而死亡。这种细胞株多数用人胚肺组织建立细胞系。二倍体细胞株既可用于分离病毒，又是疫苗生产中首选的细胞株。
二倍体细胞株的建立并不容易，特别是从第三代到第七、第八代是最不稳定时期。操作中要注意，在建株传代过程中，原代培养的组织要尽量取自动物胚胎或新生动物，并立即培养。试验设计出该种细胞最适宜的生长液和维持液配方，其营养成分应适度丰盛，尤其在生长困难的前期。传代时选用合适的消化剂，尤其应注意消化时间不能过长。传代时接种的细胞数要比一般高0.5～1 倍，宁多勿少，且要利用原瓶传代。培养温度的选择要根据组织来源和动物种类而定。培养过程中要根据继代细胞的形态、增殖程度和营养液pH 等，适时换液和传代，特别要注意在细胞生长最旺盛、形态最好的时候传代。在原代培养中加入一些消化后残剩的小组织块与单个细胞，同瓶培养传代，可提高细胞的适应性和成活率。经5～7 代培养后，生长良好的继代细胞要大量冻存于液氮中备用。在继代过程中，每隔8～10 代，应对细胞染色体组型进行检查，看是否仍为二倍体。若染色体组型已经改变，则成为可以无限传代的细胞系。
③传代细胞系培养。
传代细胞系是指能在体外无限制增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变形成。这类细胞染色体数目不正常，为异倍体。它的优点是容易培养，生长迅速，随时可获得；缺点是有的细胞系对分离样品中的野毒不敏感，而且在实验室传代过程中，有的可能污染支原体或有隐性感染的病毒。常用的传代细胞系有HeLa（人子宫癌细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）、BHK-21（乳仓鼠肾细胞）、PK-15（猪肾细胞）等，不用时保存于液氮罐中，用时取出培养复苏。复苏细胞时，将冻存细胞置于37℃水浴速溶，离心后悬浮细胞沉淀，加入含有10% FCS 的营养液，37℃条件下培养至长成细胞单层。传代细胞系有专门机构负责鉴定和保管。
传代细胞系的培养方法基本相同，本书以Vero 细胞培养方法为例加以说明。培养传代时，取已形成单层的细胞培养瓶，弃去维持液，用Hank’s 液洗2～3 遍后，加入约为原培养液量1/3 的0.25%胰酶溶液，室温或37℃水浴消化，待细胞面开始脱落时，翻转培养瓶弃去大部分胰酶溶液，再翻转培养瓶让残留胰酶溶液继续消化，并加入少量营养液轻晃、冲洗细胞后弃去，再加入适量营养液，用吸管充分吹打至细胞完全分散，按1∶3 的比例进行传代，即1 瓶传3 瓶。2～4 d 换液，在快长成单层时接种病毒。
（4）细胞培养的方法
细胞培养的基本方法分为2 类，即细胞单层培养和细胞悬浮培养。单层培养是研究病毒生物学特性及病毒与细胞相互作用的合适模型，是目前病毒学研究中应用最广泛的细胞培养方法，又分为静置培养、旋转培养2 种。
①静置培养。
静置培养指将消化分散的细胞悬液分装入培养瓶或细胞培养板中，静置于二氧化碳培养箱内，数天后细胞可生成贴壁的单层细胞。培养量一般不超过总体积的1/3，液体厚度不超过1 cm，以足够的空间保证细胞培养中细胞对氧的需要。温度视不同动物细胞种类而有所区别，一般哺乳动物和禽类细胞的培养温度为37±1℃，昆虫细胞的培养温度为25±1℃。
于旋转培养。
基本方法与静置培养相同，不同之处是要将培养的细胞持续缓慢旋转5～10 r/min，一段时间后，细胞在培养瓶的四壁长满单层。此法产量高，适于疫苗生产。某些病毒，如轮状病毒、冠状病毒，旋转培养比静置培养分离野毒更易获得成功。
③悬浮培养。
悬浮培养是指通过搅拌使细胞处于悬浮状态，并补充营养和校正pH，使之生长或维持存活的方法。此法适用于某些不需要贴壁生长的细胞系，如NS-1（一种骨髓瘤细胞系），或做特殊研究之用。细胞悬浮培养时，要严格密闭，一般每分钟搅拌300～500 次，同时要保证氧与营养成分的充分供应，常用双倍浓度的氨基酸及维生素等，且在培养过程中需多次追加营养液，以保证细胞的大量和快速繁殖。在细胞培养过程中，必须定期采样进行细胞计数，并测定细胞活力，一般要求活细胞占细胞总数的90%以上。
④微载体培养。
微载体培养是指以悬浮培养为基础，结合微载体的细胞培养技术，于1967由Van Wezel 首先创立。微载体是直径为35～100 μm 的微小颗粒，对细胞无毒性，按一定比例放入混悬培养的营养液中，细胞可贴附其上长成单层。因微载体数量巨大，故所获得的细胞数比常规方法大为增加。微载体培养应用前景广阔，不仅可用于规模化生产细胞、疫苗、病毒抗原、干扰素及单克隆抗体等，而且可用于生产基因重组产品。微载体有若干型号，已商品化。目前应用较多、效果较好的是瑞典产的CytodexI、Ⅱ、Ⅲ型微载体。
（5）细胞克隆技术
原代细胞在传代过程中常出现优势细胞减少而其他细胞增多的现象。二倍体细胞株及传代细胞系在长期传代过程中，因细胞自身的变异及传代条件的改变等，也会出现细胞分化，产生生物性状不一致的细胞群体，因此细胞的纯化很有必要。细胞克隆技术是指从一般细胞株的培养物中，获得由一个单细胞后代增殖细胞群体的技术。所获得的这种生物学性状一致的细胞培养物称为克隆化细胞株，从而达到细胞纯化筛选的目的。细胞克隆技术的方法包括毛细管法、终点稀释法、微滴法、饲养细胞层法及软琼脂法等，这里主要介绍终点稀释法。为使营养液更好地适应单个细胞的生长和增殖，可将营养液条件化，取即将长成单层的同类细胞新培养物，弃原来的培养液，加入新营养液，37℃条件下培养1 d 后吸出营养液，以微孔滤膜或3 000 r/min离心30 min，除去可能混悬于其中的细胞，取上清液装瓶备用。将旺盛生长期的单层细胞培养物用胰酶消化下来后，用条件化的营养液做10～107 的高倍稀释，然后从105 开始，以每个稀释度至少接种50 个孔的量分别接种微量培养板，培养48～72 h，在倒置显微镜下观察，取最高稀释度有细胞增殖的孔，用胰酶消化并扩增培养后，继续按上述方法重复克隆2 次以上，即可获得克隆细胞株（系）。
4.病毒的接种方法
接种病毒前，要先制备病毒悬液。细胞在生长过程中会分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞培养量少，这些分泌物也会少，细胞增殖速度就会变慢；细胞培养量大时，则细胞增殖速度快。一般按照维持液1%～10%（V/V）的量接种病毒。如果病毒接种量少，细胞不能完全被感染，影响病毒效价；如果病毒接种量多，会产生大量无感染性缺陷病毒。