组织病理学技术
组织病理学是将组织切片、组织触片（压印片）或细胞（体液、分泌物、排泄物等多种样品）涂片，经不同方法进行染色后用显微镜观察。该技术的应用提高了肉眼观察的分辨力，加深了对病变的认识，同时辅以免疫学方法，对相关病原在组织原位进行定位检查，通过综合分析病变特点，可作出明确的病理诊断。
（一）病理实验室所需仪器设备及其主要用途
1.取材台或通风橱
用于对固定样品的二次取材修块，因样品大多固定于甲醛溶液中，取材需在通风良好、气体全外排的环境下进行。
2.全密闭组织脱水机
用于对所取样品的脱水、透明、浸蜡。若无条件购买，可人工在通风橱的密封标本缸中进行脱水、透明，在水浴恒温箱中浸蜡。
3.石蜡包埋机
用于对浸蜡后的样品浇注成可在石蜡切片机上切片的石蜡样品块。若无条件，可人工用溶蜡壶、玻璃板、包埋筐进行。
4.石蜡切片机
用于对包埋好的石蜡块进行切片。能否制备出质量好的薄片，切片机的质量至关重要。
5.捞片机或可控恒温水盒
用于将切好的薄片裱在载玻片上。
6.烤片机或可控恒温烤板
用于将裱好的切片烤干。用于免疫组织化学染色的切片需在37℃温箱中干片。
7.组织染色机
用于石蜡切片的常规染色或特定染色程序的染色。无条件购买时，可人工在通风橱的标本缸中进行。
8.封片机
用于对染色后的标本进行封片。无条件购买时，可在通风橱中进行。
9.温箱
免疫组织化学染色时，用于恒温孵育。
10.其他配套用品
石蜡、塑料包埋盒、不锈钢包埋模具、一次性切片刀片、载玻片、盖玻片、乙醇、二甲苯、苏木精、伊红等化学试剂。
（二）常规组织制片技术
为在显微镜下观察到组织细胞的微细结构，必须将固定后的组织切成数微米的薄片，为此通常采用石蜡包埋后切片的技术，称为常规组织制片技术。
1.制片前的准备
（1）修块
将固定好的组织样品修整至可用于制备石蜡切片的大小和形状，也称二次取材。所取样品要包括正常组织和病变组织的交界部位。若所取样品块内有多种形态，则需取多个切面，必要时可将不同部位修整成不同形状，并标记于记录纸上，以便在显微镜下观察时识别。
（2）冲洗
为消除福尔马林对染色及观察的影响，进行常规制片前，需用流水对已经修过的组织块放入包埋盒的组织样品进行1 h 以上的水洗。之后尽量控干水分，放入脱水包埋机或手动进行脱水、透明、浸蜡、包埋。用乙醇或其混合液作为固定剂时，通常不需水洗。
2.常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋
用于石蜡切片的组织需经固定、脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋，才能制备出薄片。在整个操作过程中，要掌握的原则的是脱水透明要够而不过，浸蜡的温度不宜超过64℃，否则可能使抗原活性下降，降低检出率，还可能造成组织焦脆，焦脆的组织切片时易碎，即使勉强切片，染色过程中也极易脱片，且染色效果不好。
（1）脱水
石蜡包埋的最终目的是用石蜡代替组织内的水分，从而易于在石蜡的支撑下将组织切成薄片。但石蜡不能与水互溶，固定后的组织内含有大量水分，石蜡不能浸入组织，因此需要先将组织中的水分脱去，这一过程常用梯度乙醇，因其与水可以任意比例混合。直接用高浓度酒精会引起组织快速脱水变形，通常从低浓度到高浓度逐渐过渡。
（2）透明
经酒精脱水后，组织中的水分即被酒精所代替，但酒精仍不能与石蜡相融合，需经能与两者以任一比例混合的媒浸剂置换，石蜡才能浸入组织。组织在此液内呈透明状态，因此将该步骤称为透明，一般以二甲苯作为透明剂。
（3）浸蜡
透明的组织是由透明剂替代了组织中的水分，此时将组织浸于熔化的石蜡内，石蜡即可浸入组织内部，最后组织用包埋框制备成蜡块。使组织细胞保持原有形态，具有一定的硬度可制成薄片。
（4）包埋
将组织切面置于包埋模具底面摆好，置冷台上稍加固定，浇注石蜡覆盖组织，将包埋盒底盖背侧面朝下放在其上，然后浇满整个包埋模具，使两者成为一体，置冷台冷凝变硬后，将蜡块从包埋模具中剥出。包埋好的组织内部充满石蜡，组织周围被石蜡包裹。组织的硬度和使用的石蜡硬度相同。
3.切片
（1）石蜡切片
用石蜡切片机将包埋有组织的蜡块切成薄片（为增加蜡块硬度，切片前可将蜡块置于冰上），切片厚度3～5 μm，除脑组织等细胞量较少的组织外，切片要尽可能薄。
（2）展片与裱片
石蜡切片必须展平裱在载玻片上，沥干水分后置60～65℃烤片（用于免疫组织化学染色时不烤片，置于37℃温箱过夜干燥后，用硫酸纸分别包好，于自封袋中-20℃条件下备用）。
（3）冰冻切片
将新鲜取材样品修整到可置于样品托的大小和厚度，用冷冻切片机进行快速冷冻切薄片的方法。
4.常规染色（HE）
苏木素-伊红（HE 染色）是病理组织制片技术中最常用的染色方法，被称为常规染色。
（1）基本原理
苏木素为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA。在DNA 的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木素在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在一定条件下可使细胞浆着色。细胞浆的主要成分是蛋白质，为两性化合物，细胞浆的染色与染液的pH 在胞浆蛋白质等电点（4.7～5.0）以下时，胞浆蛋白质以碱式电离，则细胞浆带正电荷，就可被带负电荷的酸性染料染色。伊红在水中离解成带负电荷的阴离子，与胞浆蛋白质带正电荷的阳离子结合，使细胞浆着色，呈现红色。染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在HE 染色中，用1%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木素的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木素染色后，必须用1%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木素染料和细胞浆吸附的苏木素染料脱去，再进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色分明。因此在HE 染色中，分化是极为关键的一步。分化后，苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经1%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色。分化后，立即用水除去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木素染上的细胞核呈蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长。
（2）染色程序
常规石蜡切片的HE 染色包括以下3 个步骤，根据实际情况可适当调整。与石蜡包埋的原理相同，因染色剂均为水溶性制剂，染色前，石蜡切片需与石蜡包埋反向脱蜡成水方可进行染色，冷冻切片经乙醇适当固定，冲洗后即可进行染色。HE 染色具体步骤：二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min、无水乙醇Ⅰ5 min、无水乙醇Ⅱ3 min、90%乙醇3 min、80%乙醇3 min、70%乙醇3 min、水洗2 min、苏木素液染色6～10 min、水洗2 min、1%盐酸乙醇20～30 s、流水水洗10～15 min、伊红液染色5 min、70%乙醇2 min、80%乙醇2 min、90%乙醇2 min、95%乙醇2 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、二甲苯Ⅰ2 min、二甲苯Ⅱ2 min，最后用中性树胶做介质，选用适当的盖玻片封固，封片时不要有气泡，树胶的浓度和用量要适宜，不要流出载玻片。显微镜下观察细胞核、软骨、钙盐、黏液和各种微生物呈蓝色，细胞质呈粉红色或桃红色，胶原纤维呈淡粉红色，红细胞呈鲜艳的橘红色。
（三）特殊（组织化学）染色技术
为显示特定的组织结构或组织细胞的特殊成分，用特定的染料和方法对切片进行染色，称为特殊染色。特殊染色能显示或进一步确定病变性质、异常物质及某些病原体，对诊断疫病具有重要作用，是对常规染色的有效补充。如针对细菌的革兰氏染色法和抗酸杆菌染色法，真菌的PAS 染色，病毒包涵体的特殊染色，支原体、衣原体、立克次体、螺旋体的吉姆萨染色法等，除以上这些外，特殊染色技术还包括器官组织成分的染色，如结缔组织染色、肌肉组织染色、脂质染色、神经组织染色，还可用于组织内蛋白质、酶类、无机盐（铁、钙、铜等）、病理性沉着物（含铁血黄素、黑色素等）等的显示。
组织病理学技术对所取组织经制片后，用不同方法进行染色再用显微镜观察，提高了肉眼观察的分辨力，加深了对病变的认识，可观察到组织病变及与周围组织细胞的关系，并可根据观察所见进行病理学诊断，其直观性和相应的准确性是其他诊断方法所不能取代的，如马立克氏病可观察到具有示病性变化的“马立克细胞”、结核病结节中的“郎罕细胞”、伤寒病时的“伤寒结节”等病变。在某些情况下，诊断需观察到病毒等致病因子与病变的关系，常规组织病理学有一定的局限性，还需采用免疫组织化学、电子显微镜等技术作为补充手段。