三、酶免疫技术
（一）原理
该技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合。其原理与操作步骤与免疫荧光技术相似，不同的是用酶代替荧光素作为标记物，并以底物被酶分解后的显色反应进行抗原或抗体的示踪。ELISA 是酶免疫技术中应用最广泛的一项技术。
ELISA 的试验原理是将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体并保持免疫活性。测定时，将待检样品和酶标抗原或抗体，按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，形成酶标抗原抗体复合物，用洗涤的方法分离未结合的游离成分，加入底物后，底物被酶催化成有色产物。产物的量与待检样品中受检物质的量直接相关，根据颜色深浅判定结果。
目前，在兽医实验室广泛应用的ELISA 方法，根据检测目的和操作步骤的不同，主要有用于检测抗体的竞争法/阻断法、间接法、双抗原夹心法，用于检测抗原的双抗体夹心法、竞争法，此外还有用于检测IgM 的捕获法。斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）是以纤维素膜代替常规ELISA 中常用的聚苯乙烯酶标板为载体，显示底物的供氢体为不溶性的，结果以在基质膜上出现的有色斑点来判定的一种技术。
（二）操作步骤
一般ELISA 操作步骤为包被抗原或抗体于载体上，加入待检样品之后在一定温度范围内孵育一段时间，洗涤，再加酶标记物，再洗涤，加底物显色后加入终止液，再进行酶标仪读数。
（三）注意事项
1.样品保存
多数ELISA 检测以动物血清为检测样品，血清按规范采集制备，避免溶血、细菌污染。1 周以内，检测的样品可放在4℃冰箱内，超过1 周，需低温冷冻。反复冻融会使抗体效价降低，因此用于测抗体的血清样品若要保存做多次检测，宜少量分装后再冻存。
2.试剂准备
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，必须是新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH 计测量校正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后再使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3.加样
加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加样时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加样品应更换吸头，以免发生交叉污染。
4.孵育
操作要在室温条件下进行。标准室温指20～25℃。室温下反应的ELISA应在第一孔加完后即开始计时，加完整板时间要控制在3 min 以内。由于室温变化较大，推荐在25℃的培养箱中进行反应。在37℃条件下反应的试验，ELISA 板上要加盖封板膜以防水分蒸发，且ELISA 板应平铺在37℃的温箱中，避免叠放。
5.洗涤
将洗涤液注满板孔后应浸泡30 s，最后一遍洗完要吸干孔中液体，要彻底，也可甩去液体后在清洁毛巾上或吸水纸上拍干，一般重复洗涤4～5 次。
ELISA 由于具有敏感性和特异性较高，操作简便，不需要昂贵的仪器设备，成本相对较低，可实现高通量和自动化批量检测等优点，已成为当今使用最广泛的血清学技术之一。但是由于在ELISA 检测中，判定临界值是在一定的统计学基础上建立的，相对于某个具体检测样品来说，可能存在假阳性或假阴性的情况，所以ELISA 更适用于对动物群体的监测和流行病学的调查。想确定某个个体样品的检测结果时，往往需要辅以其他方法。另外所用的包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇，同时还要尽可能不含有非特异的成分。这些问题由于技术水平的限制而难以做到，因此无法完全避免假阳性和假阴性结果的发生。