实时荧光PCR技术

实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成3 个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始DNA 的拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了2 个非常重要的概念：荧光阈值和CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上，但一般是将荧光阈值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为Ct 值。Ct 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品，可画出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct 值。因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量PCR 所使用的荧光信号可分为2 种，即荧光探针和荧光染料。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使荧光基团与淬灭剂分离。TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如DyNAzymeTM II DNA 聚合酶。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量成正比关系。SYBR 荧光染料是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。在PCR 反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。实时荧光定量PCR 技术是DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，可以对DNA、RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外，还可以对PCR 产物或样品进行定性分析，例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP 检测等。目前实时荧光PCR 技术已经被广泛应用于动物疫病基础科学研究、实验室诊断及药物研发等领域。