一、病原学诊断

对本病经典的检测方法是进行产气荚膜梭菌分离鉴定，再用小鼠毒素中和试验进行分离菌的定型。

（一）产气荚膜梭菌的分离鉴定

直接取肠内容物或刮取病变部肠黏膜涂片，革兰氏染色后镜检，如果见革兰氏阳性的粗大杆菌、单个或成双排列，可做出初步诊断。还可根据葡萄糖鲜血琼脂培养基的生长形态进行鉴别，在该培养基上，菌落呈灰色、圆形、边缘整齐、表面光滑、隆起，菌落周围有双层溶血环，菌落接触空气后变绿，是本菌的特征之一。还可将培养物接种到卵黄琼脂培养基中，菌落多为圆形、微隆起、表面有皱褶。菌落周围有一个直径10～14 mm 的乳白色混浊带。另外本菌在含铁牛乳培养基中能分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，并将液面上的凡士林层向上推挤，甚至冲开管口棉塞，气势凶猛，出现“汹涌发酵”。此发酵试验对于产气荚膜梭菌具有特征性鉴定意义。在羊致病性梭菌中，只有本菌无鞭毛、不运动，因此还可在硝酸盐培养基中进行动力学试验，仅沿着穿刺线生长。由于本菌能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液后，15 min 内培养基变为橙色。

（二）小鼠毒素中和试验

包括毒素检查和毒素定型2 个方面。取回肠内容物，视其浓度加适量生理盐水，离心后取上清液静脉注射小鼠，如小鼠出现昏迷或很快死亡，证明肠内容物含有毒素。另取部分样品，用1%胰蛋白酶处理（胰酶处理对ε 毒素起激活作用，对α 毒素起灭活作用），再接种小鼠，若有毒素存在，小鼠会在12 h内死亡。传统的毒素定型方法是用小鼠做血清中和试验，即按照常规法，先测得毒素的最小致死量，再与标准B 型、C 型和D 型产气荚膜梭菌抗毒素做毒素中和试验。小鼠毒素中和试验虽然经典，但由于操作烦琐，试验周期长，且常常受到实验动物来源和品质的影响而造成误判。近年来随着分子生物学技术的发展，已有新的诊断方法，如PCR、核酸探针等技术，实现了对产气荚膜梭菌的特异、敏感和快速诊断。

（三）抗原检测

用D 型产气荚膜梭菌的菌体抗原制备多肽，用胶体金标记多抗，制成标记探针，建立胶体金免疫层析检测方法。还可以根据细菌形成的毒素蛋白是细菌基因编码表达产物的基本原理，采用SDS-PAGE 方法测定毒素蛋白的分子量，从而确定产气荚膜梭菌的毒素种类。制备或使用标准抗毒素、抗肠毒素包被反应板，建立直接ELISA、Dot-ELISA、双抗体夹心ELISA、捕获ELISA 等检测D 型产气荚膜梭菌相应的毒素和肠毒素。

（四）分子诊断技术

对产气荚膜梭菌的分子诊断技术多是针对该菌的4 种主要毒素α、β、ε、ι 的基因完成检测。通过对毒素基因的检测，实现产气荚膜梭菌的鉴定和分型同步完成。