核酸片段多态性分析

目前，应用于兽医实验室的多态性分析技术主要是限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、随机扩增的多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）和扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）。

（一）限制性片段长度多态性（RFLP）

RFLP 技术于1980年由人类遗传学家Bostein 提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis-Keller 利用此技术于1987年构建了第一张人的遗传图谱。RFLP 技术检测DNA 在限制性内切酶消化后形成的特定DNA 片段的大小，因此凡是可以引起酶切位点变异的突变，如点突变和一段DNA 的重新组织等，均可通过RFLP 发现。限制性内切酶是一类具有特殊功能的核酸切割酶，不同的内切酶可辨认并作用于特异的DNA 序列，并将DNA 切断，RFLP 主要应用于3 种限制性内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA 的甲基化，又能催化非甲基化的DNA 的水解。Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA 的水解。III 型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。该试验的操作步骤包括不同个体DNA 的提取、限制性内切酶酶切DNA 片段、对限制性酶切片段进行凝胶电泳、转膜、变性、与标记探针杂交、洗膜、结果分析。RFLP 技术处理数据多态信息量大，呈共显性标记，不受显隐性关系、环境条件、发展阶段及组织部位影响，结果稳定，重复性好。但RFLP 分析对样品纯度要求较高，样品用量大，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，使多态性降低，且步骤繁琐、周期长、工作量大、成本高，应用受到一定限制。

（二）随机扩增变态性DNA（RAPD）

RAPD 技术是1990年发明并发展起来的。RAPD 是建立在PCR 基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA 为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10 个碱基对）为引物，在热稳定的DNA 聚合酶（Taq 酶）作用下，进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙啶染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。该试验的操作步骤包括DNA 提取、随机引物进行PCR 扩增、凝胶电泳、图谱分析。该技术的特点是不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害；可以在物种没有任何分子生物学研究的情况下分析其DNA 多态性；对模板DNA 的纯度要求不高；技术简单，无需克隆DNA 探针，无需进行分子杂交；灵敏度高，可提供丰富的多态性；RAPD 引物没有严格的种属界限，同一套引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。但是RAPD 技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度、短的引物序列、PCR 的循环次数、基因组DNA 的复杂性、技术设备等，都有可能是RAPD 技术重复性差的直接原因。目前，多从以下几个方面来提高反应的稳定性：首先是操作规范，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD 反应标准化；其次是提高扩增片段的分辨率；最后是将RAPD 标记转化为SCAR 标记后再进行常规的PCR 分析，可以提高反应的稳定性及可靠性。

（三）扩增片段长度多态性（AFLP）

AFLP 技术是1993年由荷兰科学家Zbaeau 和Vos 首先建立起来的一种检测DNA 多态性的新方法。AFLP 是RFLP 与PCR 相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA 产生不同大小的DNA 片段，再使双链人工接头的酶切片段相连接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1～3个选择性核苷酸作引物，对模板DNA 基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA 扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由3 部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3’端的选择碱基序列（1～10 bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。该试验的操作步骤包括模板DNA 的制备、双酶切及连接、PCR 预扩增、PCR 选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。AFLP 结合了RFLP 和RAPD 2 种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管AFLP 技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是一种十分理想、有效的分子标记技术。