二、聚合酶链反应
（一）聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）
美国人Mullis 于1983年首先提出设想，1985年发明聚合酶链反应，即简易DNA 扩增法，意味着PCR 技术的真正诞生。发现耐热DNA 聚合酶-Taq酶对于PCR 的应用有里程碑意义。该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR 技术变得非常简捷，同时大大降低了成本，PCR 技术得以大量应用，并逐步应用于各类实验室。该技术的原理是DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的2 分子拷贝。在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，加入设计引物、DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。PCR 由变性、退火、延伸3 个基本反应步骤构成。首先是模板DNA 的变性。模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。其次是模板DNA 与引物的退火（复性）。模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合。最后是引物的延伸。DNA 模板和引物结合物在72℃、DNA 聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性、退火、延伸3 个过程，就可以获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 min，2～3 h 就能将待扩目的基因扩增、放大几百万倍。
1.PCR 的体系
包括dNTP 混合物，它是提供DNA 结构的基础元件。引物是DNA 聚合酶无法从无到有合成DNA，需要一个3’羟基，引物就是这个作用。TaqDNA聚合酶是DNA 聚合酶的一种，耐高温，保持高活性，使得PCR 得以进行几十个循环。最后还有PCR 缓冲液，为整个反应提供一个合适的环境。PCR 操作包括核酸提取、PCR 反应体系、PCR 扩增反应和电泳。
2.PCR 试验的特点
PCR 扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物决定的。反应初期，原来的DNA 担负起始模板的作用，伴随循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5’之间的DNA 片段。PCR 试验的优点是特异性强、灵敏度高、简便快速、对样品的纯度要求低且成本相对较小。缺点是引物会引导一定的错配，产生假阳性，并且容易受外源DNA 的污染，凝胶电泳时需要用核酸变性剂（溴化乙啶），对人体有害等。
3.PCR 方法的应用
在兽医实验室检测中，PCR 技术已广泛应用于动物病毒病、细菌病、寄生虫病和支原体病等的检测。已经有许多动物疫病的诊断，尤其是一类动物疫病的PCR 诊断被列入国家标准中。
（二）以PCR 为基础的常用分子诊断技术
在PCR 基础上衍生多种分子诊断技术。
1.逆转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）
RT-PCR 用于RNA 病毒目的片段的扩增，利用逆转录酶能将RNA 逆转录成DNA 的特性，用合适的引物，将样品细胞内的RNA 逆转录成cDNA，然后以cDNA 为模板进行PCR 反应，将cDNA 扩增成大量的双链DNA。该试验的操作步骤主要包括反转录、预变性、变性、退火、延伸、电泳、结果判定。RT-PCR 操作可分为一步法和两步法。一步法是将cDNA 与PCR 之间的过程省略，快速、简便、敏感，减少了污染的机会，减少了RNA 二级结构，聚合酶具有校正活性，减少了PCR 反应错配率。两步法首先AMV 反转录酶或M-MLV 反转录酶、Tth DNA 聚合酶合成cDNA，然后以cDNA 为模板进行PCR 扩增。两步法将RNA 转录为cDNA，易于保存。RT-PCR 就是在PCR 扩增前增加了一步逆转录的过程。
2.套式PCR/RT-PCR
套式PCR，又称巢式PCR，是一种变异的聚合酶链反应，使用2 对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR 引物扩增片段和普通PCR 相似。第二对引物称为巢式引物（因为它们在第一次PCR 扩增片段的内部）结合在第一次PCR 产物内部，使得第二次PCR 扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR 的优点是，如果第一次扩增产生了错误片段，第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR 的扩增非常特异。该试验的操作步骤主要包括提取核酸、外引物进行第一轮扩增、内引物进行第二轮扩增、PCR产物电泳检测。
3.多重PCR/RT-PCR
多重PCR（multi-PCR），是在同一PCR 反应体系里加上2 对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR 相同。该试验的操作步骤与PCR/RT-PCR 相同，仅仅是增加了若干对引物。多重PCR 主要用于动物多种病原的同时检测，或鉴定某些动物病原、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原的同时检测或鉴定，是在同一PCR 反应管中同时加上多种病原的特异性引物，进行PCR 扩增，可用于同时检测多种动物病原体或鉴定出是哪一型病原体感染。