分子病理学诊断技术
分子病理学诊断技术是利用分子生物学的灵敏性和高效扩增特性，与免疫病理学的定位性相结合的方法，对组织细胞内的核酸等物质进行定性、定位或定量检测。由于实验条件要求高，所需仪器设备昂贵，目前兽医领域，除一些研究性工作外，在疫病诊断中不经常应用。这里仅对原位杂交、原位PCR 技术进行简单阐述。
（一）原位杂交技术
原位杂交技术是应用分子生物学的核酸杂交原理，组织切片、细胞涂片原位不经核酸提取步骤，直接进行核酸杂交，在显微镜或电镜下观察杂交信号的一项新技术。该技术广泛应用于医学基础研究、细胞遗传学、肿瘤、生物学剂量测定和病原学诊断。
1.基本原理
不经过体外核酸提取步骤，在组织细胞原位，将标记的目的核酸探针与组织或细胞内待检DNA 或RNA 互补配对。结合成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA 双链分子，应用与标记物相应的检测系统显色，在显微镜或电镜下对阳性物质进行细胞内定位。
2.基本程序
杂交前准备（固定、玻片和组织处理）、杂交、杂交后处理、杂交后检测和结果判定。
固定的目的是保持细胞生理状态下的形态结构和最大限度地保存细胞内目的DNA 或RNA，特别是易被降解的RNA。最常用的固定剂是4%多聚甲醛。因杂交过程中温度变化大，容易造成脱片，因此需要用免洗玻片或经去油、去污处理的洁净载玻片，涂布多聚赖氨酸、3’-氨丙基三乙氧硅脘等较牢固的防脱片剂，制备尽量薄的切片等方法防止组织脱片。染色前还要对组织切片进行处理，充分脱蜡，TritonX-100 去污处理（过度会引起靶核酸的丢失，组织形态结构受损）、蛋白酶K 消化以增强组织和细胞膜的通透性。并用0.25%醋酸酐处理以降低非特异本底，通过预杂交封闭组织中非特异性杂交点。再将杂交液（10～20 μl/张）滴加至切片标本上，置湿盒中，根据检测标本所需温度（通常DNA-DNA 37℃、DNA-RNA 42～44℃、RNA-RNA 48～50℃）过夜进行杂交孵育（杂交时间与探针浓度呈负相关，时间为4～24 h）。杂交后处理包括用系列不同浓度、不同温度的盐溶液漂洗。漂洗的原则是盐浓度由高到低，温度由低到高。最后时进行杂交检测，检测需根据探针标记物的种类分别进行。具体操作方法可参考免疫组化技术，如荧光标记直接用荧光显微镜观察，酶标记底物显色后用光学显微镜观察，同位素标记通过放射自显影观察。在组织对照、探针对照、杂交反应对照和检测系统对照成立的前提下判定结果。
（二）原位PCR
原位PCR 技术是在组织细胞原位进行PCR 扩增，以检测单拷贝或低拷贝特定DNA 或RNA 序列的一种方法，是将PCR 扩增与原位杂交检测相结合建立的一项新技术，可检测内源性和外源性基因。
1.基本原理
直接在组织或细胞样本上原位扩增目的片段（不改变靶基因定位），经过PCR 反应，使原有细胞内单拷贝或低拷贝的特定目的核酸序列呈指数扩增，再应用标记的探针以原位杂交方法检测扩增产物。
2.基本程序
扩增前准备（固定、取材、玻片和组织预处理等）、原位PCR 仪扩增、扩增产物的检出。通常根据扩增产物内是否含标记物，分为直接法和间接法。因直接法特异性差，易出现假阳性，特别不适用于组织切片检测，因此一般采用间接法。
取材要新鲜，固定要及时，固定液和玻片组织预处理同原位杂交技术。然后脱蜡、去污、酶消化、去除内源酶，再进行原位PCR 扩增，用原位PCR 仪在组织细胞片上进行，反应过程不带任何标记物，由组织细胞内目的基因原位扩增。最后是原位杂交检测特异性扩增产物，具体方法同原位杂交。