一、病原学诊断

（一）显微镜检查

采集病牛的病灶、痰、尿、粪便、乳及其他分泌物样品，做抹片或集菌处理后抹片，用萋-尼氏抗酸染色镜检，抗酸杆菌呈特征性红色，而其他细菌和细胞呈蓝色。其中痰涂片抗酸染色法快速、灵敏度低、特异性差，需要观察者有丰富的经验积累，至少需要有每升大于5×106 的细菌才能检测到阳性结果。

（二）牛结核分枝杆菌的培养

先将组织样品在研钵或匀浆器中匀浆，后用酸或碱（常用5%草酸或2%～4%氢氧化钠）去除污染。混合物在室温条件下作用10 min，用无菌生理盐水反复离心洗涤沉淀2 次后，沉淀物用于培养和显微镜检查。将采集的痰液、尿液、乳汁及其他分泌物等或组织病料处理沉淀物，接种于含鸡蛋2 份罗杰二氏培养基、2 份Petragnane 培养基、2 份Stonebrink 氏培养基中培养，置于37℃条件下8～10 周。培养基加塞密封或放入密封管中，以防干燥。培养期间定期观察其生长情况，牛结核杆菌一般在培养3～6 周后出现菌落。挑取菌落制备涂片，用萋-尼氏抗酸染色法染色。在不加丙酮酸的罗氏培养基时生长良好，但加入甘油后生长不良。将牛分枝杆菌与引起结核病的其他成员区分开十分重要。根据其特征性菌落和形态可以做出初步诊断，确诊需做生化鉴定（烟肼和硝酸化）。分离菌的鉴定可通过测定其培养特性和生化特性进行，在丙酮酸盐罗氏固体培养上，牛分枝杆菌属光滑型菌落，呈灰白色。

（三）核酸检测方法

牛结核病PCR 检测对本病的早期诊断具有独特的优势。目前检测牛分枝杆菌的引物已经在人医和兽医领域广泛应用，包括16S～23S rDNA 的扩增序列，IS6110 和IS1081 的插入序列，以及编码特异性结核杆菌复合体蛋白的基因，如MPB64 和38kD 抗原。

（四）DNA 分析技术

目前，国内外应用于结核分枝杆菌复合群的基因分型方法主要有2 类：一类是以限制性片断长度多态性为基础的方法，是将整个基因组用限制性内切酶切片DNA 片断，再用脉冲场凝胶电流将DNA 片段分离开，电泳完毕用探针进行杂交，最后形成DNA 指纹图谱。另一类是以基因组特定多态性区域序列进行PCR 扩增为基础的方法。此方法操作简单迅速，不需要特殊仪器，且需菌量少，分辨率高，结果可以形成数字化，成为继限制性片断长度多态性方法之后更为广泛应用的分型方法。目前，国际上普遍上应用的方法是数目可变串联重复序列方法和间隔寡核苷酸定型Spoligotyping，它是基于识别H37Rv 基因组的11 个串联重复区而建立的方法。