细菌分离培养技术
细菌分离培养是细菌学检验的重要环节，正确分离培养有助于快速得到可疑的致病菌，对动物疫病的诊断与防控非常重要。以下主要介绍培养基的分类及灭菌技术、细菌接种培养及细菌培养的注意事项等。
（一）培养基分类和制备技术
培养基是供微生物、植物组织和动物组织生长与维持用的人工配制的养料。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素、水等。不同培养基可根据实际需要，添加一些自身无法合成的化合物，即生长因子。有些微生物，如自养型微生物，不需要碳源。目前通常采用各种干粉培养基成品，用蒸馏水配制。此种培养基使用方便，但是传统培养基的制备仍是最经济实用的。
1.培养基的分类
微生物培养基的种类繁多，一般常以培养基的组分、物理性状、用途和性质来区分。
（1）根据培养基的组成成分分类
根据培养基营养组成的差异，可将培养基分为天然培养基和合成培养基、半合成培养基3 类。天然培养基主要取自动物体液或从动物组织中分离提取。其优点是营养成分丰富，培养效果良好；缺点是成分复杂，来源受限。天然培养基/液的种类很多，包括生物性液体（如血清）、组织浸液（如胚胎浸液）、凝固剂（如血浆）等。合成培养基是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的，其所含成分（包括微量元素）的量都是确切可知的。合成培养基一般用于在实验室中进行的营养、代谢、遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究。半合成培养基又称为半组合培养基，指用天然原料加入一定的化学试剂配制而成的培养基。其中天然成分提供碳、氮源和生长素，化学试剂补充各种无机盐。这种培养基在生产和实验中使用较多。
（2）根据培养基的物理性状进行分类
根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少，可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基3 种类型。在液体培养基中加入一定量的凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件：不被所培养的微生物分解利用；在微生物生长的温度范围内保持固体状态，在培养嗜热细菌时，由于高温容易引起培养基液化，通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题；凝固剂凝固点温度不能太低，否则将不利于微生物的生长；凝固剂对所培养的微生物无毒害作用；凝固剂在灭菌过程中不会被破坏；透明度好，黏着力强；配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶。液体培养基中不加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基中的少，培养基中琼脂含量一般为0.2%～0.7%。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。
（3）根据培养基用途和性质进行分类
基础培养基是指含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。基础培养基广泛应用于细菌的增菌、检验。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基，这种培养基可作为一些特殊培养基的基础成分。营养培养基是指在基础培养基中加入某些特殊的营养物质，如血液、血清、酵母浸膏或生长因子等，供营养要求较高和需要特殊生长因子的微生物。鉴别培养基是指利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，观察细菌生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的不同反应来鉴别细菌，主要用于不同类型微生物的快速鉴定，如常用的伊红美蓝琼脂等。选择性培养基是指根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。厌氧培养基是指厌氧菌必须在无氧的环境中才能生长，凡适用于厌氧菌生长的培养基均称为厌氧培养基。进行厌氧培养的方法，一是将培养基放在无氧环境中培养；二是在培养基中加入还原性物质，降低培养基的氧化还原电势，并在培养基表面用凡士林或石蜡封闭，使培养基与外界空气隔绝，让培养基本身成为无氧的环境。
2.培养基的制备
首先是称量药品。根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯，不要加入琼脂，蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。用量筒取一定量（约占总量的1/2）的蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他原料，待完全溶化后，补足水分。根据培养基对pH 的要求，用5% NaOH 或5% HCl 溶液调至所需pH。测定pH 可用pH 试纸或酸度计等。固体或半固体培养基须加入一定量的琼脂。加入琼脂后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。注意控制火力，不要使培养基溢出或烧焦。先将过滤装置安装好，如果是液体培养基，玻璃漏斗中放1 层滤纸；如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或2 层纱布夹1 层薄薄的脱脂棉，趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4 左右为宜，固体分装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3 为宜。分装三角瓶，量以不超过三角瓶容积的1/2 为宜。培养基分装好后加棉塞或试管帽，再包1 层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称、制备组别和姓名、日期等。上述做好的培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20 min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成分。培养基灭菌后，如需要做斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2 为宜。半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。将需倒平板的培养基置于水浴锅中冷却到45～50℃，立刻倒平板。每批培养基制成后须经检定方可使用。检定时将培养基放入37℃温箱内培养24 h 后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上的生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。制好的培养基放在4℃冰箱内备用。培养基不宜保存过久，以少量勤做为宜。
3.注意事项
（1）选择适宜的营养物质
所有微生物的生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求不一样，因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。
（2）营养物质浓度及配比合适
培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低不能满足微生物正常生长所需，浓度过高则可能对微生物生长起抑制作用，例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而会起到抑菌或杀菌作用。另外培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖及代谢产物的形成与积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。严格地讲，碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质量的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。
（3）控制pH 条件
培养基的pH 必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH 条件各不相同，一般来讲，细菌与放线菌适于在pH 7～7.5 范围内生长，酵母菌和霉菌通常在pH 4.5～6 范围内生长。需要注意的是，在微生物生长繁殖和代谢的过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累会导致培养基pH 发生变化，若不对培养基pH 条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或代谢产物产量下降。因此，为了维持培养基pH 的相对恒定，通常在培养基中加入pH 缓冲剂。常用的缓冲剂是一氢磷酸盐和二氢磷酸盐（KH2PO4和K2HPO4）组成的混合物。在培养基中还存在一些天然的缓冲系统，如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质，也可起缓冲剂的作用。
（4）控制氧化还原电位
不同类型微生物生长对氧化还原电位（F）的要求不一样，一般好氧性微生物F 值为+0.1 V 以上时可正常生长，一般以+0.3～+0.4 V 为宜。厌氧性微生物只能在F 值低于+0.1 V 条件下生长。兼性厌氧微生物在F 值为+0.1 V以上时进行好氧呼吸，在+0.1 V 以下时进行发酵。F 值与氧分压和pH 有关，也受某些微生物代谢产物的影响。在pH 相对稳定的条件下，可通过增加通气量（如振荡培养、搅拌）提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加F值。在培养基中加入抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等还原性物质可降低F 值。
（5）灭菌处理
要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此需对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格地灭菌。对培养基，一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基在121.6℃条件下维持15～30 min 可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常在112.6℃条件下15～30 min 进行灭菌。某些对糖类要求较高的培养基，可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合。长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子（特别是钙、镁、铁离子）结合形成难溶性复合物而产生沉淀，因此在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时，常需在培养基中加入少量螯合剂，避免培养基中产生沉淀。常用的螯合剂为乙二胺四乙酸（EDTA）。还可以将含钙、镁、铁等离子的成分与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌，然后再混合，以避免形成沉淀。高压蒸汽灭菌后，培养基pH会发生改变（一般使pH 降低），可根据所培养微生物的要求，在培养基灭菌前后加以调整。
（二）病料采集和处理
1.采集病料的方法
采集细菌学检查用的病料，要求无菌操作，以避免污染。使用的工具要煮沸消毒，使用前再经火焰消毒。在实际工作中无法做到时，最好取新鲜的整个器官或大块的组织及时送检。剖检时，器官表面常被污染，故在采集病料之前，应先清洁及杀灭器官表面的杂菌。在切开皮肤之前，局部皮肤应先用来苏儿消毒。采取内脏时，不要触及其他器官。如果当场进行细菌培养，可用烙铁刀在酒精灯上烤至红热，烧灼取材部位，使该处表层组织发焦，然后立即取材接种。
血液的采集，心血一般以毛细吸管或10 mL 的注射器穿过心房刺入心脏内。普通注射器也可用来采血，但针头要粗些。心血抽取困难时可以挤压肝脏。全血用20 mL 无菌注射器，吸5%柠檬酸钠溶液1 mL，然后从静脉采血10 mL，混匀后注入灭菌试管或小瓶内。血清要无菌操作从静脉吸取血液，血液置室温中凝固1～2 h 然后置4℃条件下过夜，使血块收缩，将血块从容器壁分离，可获取上清液即血清部分。或者将采取的血液置于离心管中，待完全凝固后，以3 000 r/min 的速度离心10～20 min，也可获取大量血清。然后将血清分装保存。若很快即用于检测，则保存于4℃冰箱中。若待以后检测，则保存于-20℃或-70℃低温冰柜中。血液涂片的载玻片应先用清洗液浸泡，然后用水洗净后放入95%酒精中，之后干燥后备用。涂血片可在耳尖采血。将推片与玻片形成30°角接触，使标本液在2 片之间迅速散开。按上述角度在载玻片上轻轻匀速地自右向左移动，至标本液完全均匀地分布于载玻片上。涂片时应操作轻巧，以免损伤细胞。涂片要求薄而匀。一般用力轻，推移快，则涂片多较厚；用力重，推移速度慢，则涂片较薄。涂片后最好待其自然干燥。
实质脏器的采集是用无菌用具采取组织块放于灭菌的试管或广口瓶中，取的组织块大小约2 cm2 即可。若不是当时直接培养而是外送检查时，组织块要大些。要注意各个脏器组织分别装于不同的容器内，避免相互污染。胸腹水、心囊液、关节液及脑脊髓液以消毒的注射器和针头吸取，分别注入经过消毒的容器中。脓汁和渗出物用消毒的棉花球采取后，置于消毒的试管中运送。检查大肠杆菌、肠道杆菌等时可结扎一段肠道送检，或先烧灼肠浆膜，然后自该处穿破肠壁，用吸管或棉花球采取内容物检查，或装在消毒的广口瓶中送检。细菌性心瓣膜炎可采取赘生物培养及涂片检查。乳汁的采集是先将乳房和乳房附近的毛以及术者的手洗净消毒。将最初的一些乳汁弃去，然后采取乳汁10～20 mL 于灭菌容器中。涂片或印片的制作在细菌学检查中颇有价值，尤其是对于难培养的细菌，更是不可或缺的手段。普通的血液涂片或组织印片用美兰或革兰氏染色。结核杆菌、副结核杆菌等用抗酸染色。一般原虫疾病需做血液或组织液的薄片及厚片。厚片的做法是用洁净玻片，滴1 滴血液或组织液于其上，使之摊开约1 cm 大小，平放于洁净的37℃温箱中，干燥2 h 后取出，浸于2%冰醋酸4 份和2%酒石酸一份混合液中，5～10 min 脱去血红蛋白，取出后再脱水，并于纯酒精中固定2～5 min，进行染色检查。若本单位缺乏染色条件需寄送外单位进行检查，还应该把一部分涂片和印片用甲醇固定3 min 后不加染色一起寄出。此外，脓汁和渗出物也可以采用本方法。
2.采集病料的注意事项
发现突然死亡或死因不明的病畜尸体，必须先采集耳静脉等末梢血液涂片镜检。在认定不是炭疽时，才可以解剖和全面采集病料。采集病料最好在动物生前使用药物之前，或死后立即进行，夏季最多不超过6 h。所用器械、容器都必须消毒灭菌，操作中应尽量避免杂菌污染。采完病料后，对解剖场地及尸体、脏器要彻底消毒。一件器械只能采集一种病料，否则必须经酒精、火焰或煮沸消毒后才能再用。不同的病料应分别装入不同的容器内。采集病料的种类应根据各种传染病的特点采集相应的脏器、分泌物或排泄物。无法判断是什么传染病时，应全面采集。
（三）细菌的分离和接种
1.平板划线接种法
通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分地分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落做纯培养。具体的接种方法是右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠地来回划线，面积约占整个平板的1/5～1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30°～40°角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域，是否需要烧灼灭菌，视标本中含菌量的多少而定），待冷却后，在划线末端重复划2～3 根线后，再划下一区域（约占1/4 面积），此为第二区。第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。划线完毕，将平板扣入皿盖并做好标记，置37℃温箱中孵育18～24 h，观察琼脂表面菌落的分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
2.液体培养基接种法
凡肉汤、蛋白胨水、各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别。操作方法是右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。左手拇指、食指、中指托住液体培养基下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，蘸取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中。管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，在37℃温箱中孵育18～24 h，取出观察生长情况。
3.半固体穿刺接种法
此法主要用于观察细菌动力、保存菌种。操作方法是用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处，沿原路退回。管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37℃温箱中孵育18～24 h，取出后对光观察穿刺线上细菌的生长情况，细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。
4.斜面培养基接种法
常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。操作方法是用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回做蜿蜒划线。管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置37℃温箱中孵育18～24 h，取出观察斜面上菌苔的生长情况。
（四）细菌的培养方法
根据培养细菌的目的和培养物的特性，培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法3 种。一般培养法是将已接种过的培养基置于37℃培养箱内18～24 h，需氧菌和兼性厌氧菌即可在培养基上生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3～7 d 甚至1 个月才能生长。为使培养箱内保持一定湿度，可在其内放置1 杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石蜡或凡士林封固，以防培养基干裂。二氧化碳培养法是指某些细菌，如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等，需要在含有10%二氧化碳的空气中才能生长，尤其是初代分离培养要求更为严格。将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即为二氧化碳培养法，二氧化碳培养箱可将已接种的培养基放入箱内孵育，即可获得二氧化碳环境。烛缸法是将已接种的培养基置于容量为2 000 mL 的磨口标本缸或干燥器内，缸盖或缸口处均需涂凡士林，然后点燃蜡烛直立置入缸中，密封缸盖，待燃烧自行熄灭时，容器内含5%～10%的CO2，容器置于37℃条件下培养。重碳酸钠-盐酸法是指每升容积的容器内，重碳酸钠与盐酸按0.4 g 与3.5 mL 的比例，分别将2 种药各置于1 个器皿内（如平皿内），连同器皿置于标本缸或干燥器内，盖严后使容器倾斜，2 种药品接触后即可产生二氧化碳。目前常用的厌氧培养方法有厌氧罐法、气袋法及厌氧箱3 种。
（五）细菌培养的注意事项
1.严格的无菌操作
采取待检材料时的无菌操作，不论任何待检材料，必须在无菌操作下，用灭菌的器械采取，将样品放入灭菌的容器中待检。接种培养基时的无菌操作，接种用的器械，如接种环、棉棒或其他用具，在取材接种之前必须灭菌。接种培养基时，要尽可能防止外界微生物进入。
2.创造适合细菌生长发育的条件
选择适宜的培养基。如果培养基选择不当，材料中的细菌可能难以分离。为此，对待检材料进行性质不明的细菌初次分离培养时，一般尽可能地多用几种培养基，包括普通培养基和特殊培养基（如含有特殊营养物质的培养基，适于厌氧菌培养）。
3.考虑细菌所需的大气条件
对于性质不明的细菌材料最好多接几种培养基，分别放在普通大气、无氧环境内或含有5%～10%二氧化碳的容器中培养。
4.考虑培养温度和时间
一般病原菌放在35～37℃条件下培养即可，24～48 h 培养后大多数病原菌都可以生长出来。少数菌须培养较长时间（1～2 周），可见其生长。