一、免疫荧光技术

（一）原理

基本原理是将抗原和抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。荧光素是具有共轭双键体系结构的化合物，当受到紫外光照射时，由低能量级基态向高能量级跃迁，形成电子能量较高的激发态。当电子从激发态恢复至基态时，发出荧光。以异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明等荧光素作为标记物，与已知的抗体结合，但不影响其免疫学特性，然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈特异荧光的抗原抗体复合物及存在部位。根据染色过程中抗原抗体反应的不同组合，经典的免疫荧光技术分有直接法、间接法和双标记法等。

（二）操作步骤

1.制片

常见的实验室样品有组织、细胞和细菌3 类。按不同的样品可制作涂片、印片和切片。组织材料可制成冷冻切片或石蜡切片；细菌培养物、感染动物组织，或血液、脓汁、粪便、尿沉淀等，可用涂或压印片；细胞培养物可制成涂片。

2.染色

在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，置湿盒内，在一定温度下孵育一段时间，一般为25～37℃条件下30 min。用PBS 液充分洗涤、干燥，同时设标本自发荧光对照（标本+PBS）、荧光抗体对照（标本+荧光抗体）、阴性血清对照和阳性血清对照。

3.结果判定

经荧光抗体染色的标本，需在荧光显微镜下观察。染色后立即镜检。染色样本可见特异荧光，即为阳性。观察时要将形态学特征和荧光强度相结合。进行病毒检测时，针对不同特征的病毒，观察荧光所在的部位，即有的病毒呈细胞质荧光，有的病毒呈细胞核荧光，有的在细胞质和细胞核的均可见荧光。荧光强度在一定强度上反映抗体或扩原的含量。在各种对照成立的前提下，待检样品特异性荧光染色强度达“++”以上，即可判定为阳性。免疫荧光技术敏感性高、特异性强、应用范围广，但是需要使用昂贵的荧光显微镜，并且结果判定存在一定的主观性，对检测人员有一定的要求，结果存在荧光淬灭无法长期保存的缺点等。