免疫组织化学诊断技术
免疫组织化学（以下简称免疫组化）的迅猛发展是从19 世纪70年代后期开始的，继Nadane 建立酶标记抗体技术后，Sternberger 在此基础上改良并建立了辣根过氧化物酶-抗辣根过氧化物酶方法，使免疫组化技术得到了广泛应用。80年代，Hsu 等建立了抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法之后，免疫金-银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术等相继问世，使免疫组化技术成为当今生物医学、兽医学中综合研究机体形态、功能、代谢的一种常用技术。随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进，特别是单克隆抗体技术的引入，免疫组化技术在生物基础研究，如病理学、神经生物学、发育生物学、细胞生物学和微生物、寄生虫等病原体的诊断和研究中，日益显示出巨大的实用价值，并使其向临床、定量和分子水平深入。免疫组化技术也可根据标记物的不同，分为免疫荧光法、免疫酶标法、亲和组织化学法、免疫金-银法、放射自显影法等，其中最常用的是前3 种。
（一）免疫组化染色所需的仪器设备
微波炉、高压锅、水浴锅等用于抗原修复。石蜡切片标本通常用甲醛固定，固定液使细胞内抗原形成醛键、羧甲键而封闭了部分抗原决定簇，同时抗原决定簇因蛋白质间发生交联而隐蔽。因此在肿瘤等组织进行免疫组织化学染色时，通常要求先进行抗原修复或暴露抗原，打开因固定造成的分子之间的交联，恢复抗原的原有空间形态。其他的设备同常规组织病理学技术相同。
（二）免疫组化制片技术
免疫酶组化技术是用酶标记抗体，通过显色反应检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究动物疫病的目的。抗原的准确显示和定位与制备的细胞和组织标本质量息息相关。由于各种抗原的生化、物理性质不同，免疫学活性受温度、酸碱度及各种化学试剂作用的影响。良好的细胞和组织学结构有助于抗原的准确定位。因此细胞和组织标本的采集、制备在免疫组化技术中占有相当重要的位置。
1.细胞标本的取材
（1）印片法
主要应用于活组织检查标本和剖检取材标本。新鲜标本做剖面，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落的细胞便粘附在载玻片中，自然干燥后立即浸入细胞固定液内5～10 min，取出后自然干燥，低温保存备用。该方法的优点是简便省时，细胞抗原保存好；缺点是细胞分布不均匀，易出现细胞重叠，影响观察效果。
（2）涂片法
将培养细胞制成1mL 2×106 个细胞的细胞悬液，用细胞离心涂片器或注射针头式滴管涂布于载玻片上，自然干燥，冷丙酮固定，低温保存备用。若待检物为组织液、分泌物、血液等，可在载玻片上做涂片，固定后4℃条件下保存备用。
（3）爬片法
对有贴壁生长特性的细胞，可将盖玻片直接置于培养皿内，让细胞爬满盖玻片，即可得到理想的细胞标本，取出后用PBS 清洗，丙酮固定，4℃条件下保存备用。
2.组织标本取材
为避免组织自溶造成的抗原性消失、弥散现象，要尽量采取活体放血剖检动物组织，并尽快固定处理。取材时要注意取材部位为主要病变区，取病灶与正常组织的交界区，必要时取远离病灶区的正常组织做对照。
3.细胞和组织的固定
（1）固定
为更好地保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，而且最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。
（2）固定剂
用于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其要重视固定剂的选择。
①醛类固定剂。
为双功能交联剂，其作用是使组织细胞之间相互交联，保存抗原于原位。其特点是组织穿透性强、收缩性小，对IgM、IgA、J 链、k 链和λ 链的标记效果良好，背景清晰，是最常用的固定剂。常用的有甲醛、戊二醛和多聚甲醛。
于丙酮及醇类固定剂。
是最早使用免疫组化染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖类物质，对组织穿透性强，保存抗原的免疫活性好，但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞质内蛋白质的保存效果较差，一般与其他试剂混合使用，如冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原较好，平时4℃低温保存备用。临用时，只需将涂片插入冷丙酮内5～10 min，取出后自然干燥，低温冰箱保存备用。乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液，对组织穿透性极强，即使涂片含有较多黏液，固定效果仍较好，是理想的细胞固定液。
用于免疫组化的固定剂种类多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。一般选择固定液的标准是能最好地保持细胞和组织的形态结构，且最大限度地保存抗原的免疫活性。在实际工作中，中性福尔马林（或多聚甲醛）是适应性最广的固定液，但固定时间不宜过长，必要时可进行多种固定液的对比，从中选择最佳的固定液。
（3）注意事项
要尽快固定处理要取材的组织，力求保持组织新鲜、不干燥。固定时组织块不要过大、过厚，厚度不要超过1 cm，且一定要有切面，固定液的量要20 倍于组织，量太少会造成固定液浓度降低。组织固定后要充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。固定时间最好以完全浸透为宜（12～72 h），固定时间过久可能会影响染色效果。
4.组织的脱水、透明、浸蜡
同常规组织病理学技术，其中要注意的是浸蜡的温度最好不超过60℃，因此要尽量选用熔点低的蜡。
5.切片
（1）载玻片的预处理
载玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤，尤其是对一些需做酶消化、微波或高压处理、PCR 扩增的组织切片更为重要。目前常用的防脱片剂有下面几种：一是APES（3-氨丙基三乙氧硅烷），可以和组织、玻片中的氢键形成共价键。用甲醇/丙酮配成2%浓度使用。APES 使用方便，便于大量应用，且价格便宜。二是1%铬明矾明胶。还有白胶和多聚左旋赖氨酸等。
（2）切片
用石蜡切片机将包埋有组织的蜡块切成薄片，切片厚度3～5 μm，除脑组织等细胞量较少的组织块，组织要尽可能薄。40～45℃水温展片，要尽量展平，否则皱褶处易出现非特异染色。裱片时，每个载玻片上最好左右各裱一张切片。染色时，一张用于对照、一张用于检测。55～60℃温箱烤片2 h 或37℃温箱24 h 干片。处理好的切片防水密封包好，低温保存备用。
（三）免疫荧光染色技术
免疫荧光技术是将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合在一起，研究特异性抗原在细胞内分布的方法。在荧光显微镜下观察标记在抗体上的荧光素所发出的荧光信号，即可对抗原进行细胞定位。
1.基本原理
免疫荧光技术是根据免疫学抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上的荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察样品，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或橘红色），即可观察到荧光所在的组织或细胞，从而确定抗原或抗体的位置。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称为荧光抗体法。用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称为荧光抗原法。这2 种方法总称为免疫荧光技术。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等的方法称为免疫荧光组织（或细胞）化学技术。该技术又分为直接法、夹心法、间接法和补体法。
2.仪器与试剂
主要是荧光显微镜和与所检抗原对应的荧光标记抗体或抗原。
3.染色程序（以检抗原为例进行介绍）
A.在制备好的冰冻切片或细胞片上滴加0.01 mol/L pH 7.4 的PBS，10 min 后弃去，使标本保持一定的湿度。
B.在载玻片上滴加用0.01%伊文氏蓝稀释适当荧光标记的抗体（染色前标记好工作浓度）溶液，使其完全覆盖标本，置于湿盒内，孵育30 min。
C.取出玻片，置玻片架上，先用0.01 mol/L pH 7.4 的PBS 冲洗后，再按顺序过0.01 mol/L pH 7.4 的PBS 三缸浸泡，每缸3～5 min，浸泡时要不时振荡。
D.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，用盖玻片覆盖。
E.立即用荧光显微镜观察。背景组织细胞呈红色荧光，特异性荧光呈黄绿色。特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）为无荧光；（±）为极弱的可疑荧光；（+）为荧光较弱，但清楚可见；（++）为荧光明亮，每个视野内均可见；（+++ -++++）为荧光闪亮，荧光强。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
4.注意事项
A.对荧光标记抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1∶20。抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响对结果的观察。
B.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min 至数小时，一般30 min 足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0～2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min 效果好得多。
C.为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。一是标本自发荧光对照，标本加1～2 滴0.01 mol/L pH 7.4 的PBS。二是特异性对照（抑制试验），标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。三是阳性对照，已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
D.一般标本在高压汞灯下照射超过3 min，就有荧光减弱现象。经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
（四）免疫酶组织化学染色技术
1.酶标抗体法
免疫酶标抗体技术是一种综合定性、定位和定量，形态、机能和代谢密切结合为一体的研究与检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解动物疫病的发现机理和病理过程。
（1）基本原理
酶标抗体技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，在普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。根据酶标记的部位，可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等。用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的、高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上。间接法是将酶标记在第二抗体中，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
（2）标记酶
用于标记的酶，一是酶催化的底物必须是特异的，而且容易被显示，即催化反应所形成的产物易于在光镜和电镜下观察。二是酶反应的终产物所形成的沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位。三是较易获得纯的酶分子。四是中性pH 值时，酶分子要稳定。五是在酶标过程中，酶连接在抗体上不能影响二者的活性。六是在被检组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似的物质，否则结果将难以判定。
上述6 点中，前2 点最为重要，因为并非所有的容易显示的酶均能形成不溶性的复合物。符合上述要求的，最为常用的酶是辣根过氧化物酶，其次是碱性磷酸酶，除此之外，还有葡萄糖氧化酶等，但因其形成的不溶性色素扩散作用较大，在应用上受到很大限制。
（3）常用的底物显色剂
一般有2 种：一种是DAB（3，3 二氨基联苯胺），显色后阳性反应产物呈褐色；另一种是AEC（3，氨基-9-乙基卡巴唑），显色后阳性反应产物呈红色或紫红色。
（4）染色程序
常规脱蜡、1%盐酸酒精作用10 min 后，再用3%过氧化氢水溶液处理15 min，以抑制内源酶，然后蒸馏水洗2 次，用0.05%胰酶37℃条件下消化2 min，PBS 洗2 次，擦干组织周围部分后，用组化笔沿标本周边画一个圈，正常马血清（用PBS 做1∶20 稀释），37℃湿盒内作用20 min，加一抗后37℃条件下1 h 或37℃条件下0.5 h 后4℃条件下过夜。对照片略去一抗或加阴性血清，PBS 洗3 次，加AEC 显色5～10 min，苏木素衬染细胞核10 s（一过性淡染，不分化），自来水洗2 min，待切片干燥后用水溶性封片剂封片。在普通光学显微镜下观察结果，标本上出现红色或紫红色可判为阳性，用“+”表示，（-）为无红色阳性反应；（±）为极弱的可疑阳性反应；（+）为可见阳性反应；（++）为单个视野内可见2 个以上阳性反应；（+++ -++++）为单个视野内可见2 个以上强阳性反应。照相记录结果。
2.葡萄球菌蛋白A（SPA）法
（1）基本原理
SPA 具有和人与许多动物，如豚鼠、猪、小鼠、猴等IgG 结合的能力。SPA结合部位是Fc 段而不是Fab 段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA 具有的结合力是双价的，每个SPA 分子可以同时结合2 个IgG 分子，也可一方面同IgG 相结合，一方面与标记物，如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等结合。但需注意的是，葡萄球菌蛋白A 对IgG 免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如葡萄球菌蛋白A 与人IgG 亚型IgG1、IgG2 和IgG4 有结合力，唯独不结合IgG3，只结合IgA2 而不结合IgA1，葡萄球菌蛋白A 与禽类血清IgG 不结合，因此要注意可能出现的假阴性结果。葡萄球菌蛋白A 常用辣根过氧化物酶标记，可应用于间接法。
（2）染色程序
染色程序基本同酶标抗体法，仅二抗改为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A。
3.免疫组化染色结果的判定
（1）对照的设立
设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。每批染色都要以特异性阳性对照和阴性对照为基础，只有这样，才能对染色结果做出判断。对照主要针对第一抗体。
①阳性对照。
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，阳性对照成立，证明整个染色过程有效。
于阴性对照。
用确证不含已知抗原的标本做对照，应呈阴性结果，另外空白、替代、吸收和抑制试验均为阴性对照。当阴性对照成立时，才能判定检测结果，主要用于排除假阳性。
对免疫组化染色结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格进行对照试验，对发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，还要进行多次重复试验，最好用几种其他方法进行验证，如用免疫酶法染色阳性，可再用亲和组织化学、原位PCR 等方法验证。初学者必须学会判断特异性染色和非特异性染色，否则会得出不科学的结论。特异性染色和非特异性染色的鉴别点，主要在于特异性反应产物常分布于特定部位，如细胞质、细胞核和细胞表面，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果，非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围结缔组织均无区别地着色，或结缔组织呈现很强的染色。非特异性染色常出现在干燥切片的边缘、有刀痕或组织折叠的部位。过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。
（2）阳性细胞的染色特征
免疫组织化学的阳性反应呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和半定量的依据。同时阳性反应必须在特定的部位才具有诊断意义。阳性细胞染色分布有3 种类型，即细胞质、细胞核和细胞表面。大部分抗原见于细胞质，可见于整个胞质或部分胞质。阳性细胞分布可分为散在、灶性和弥漫性。由于细胞内抗原含量不同，所以染色强度不一，如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。阳性染色定位于细胞，且阳性与阴性细胞相互交杂分布。而非特异性染色常不限于单个细胞，而累及一片细胞。若仅在切片边缘、刀痕或皱褶区域、坏死或挤压的细胞区、胶原结缔组织等部位呈现阳性反应，且表现为相同的阳性染色强度，不能判定为阳性。
免疫组化方法不仅可在动物脏器组织中特异地检出病原，而且可发挥病理学检查直观、抗原定位准确的特点，如犬传染性肝炎病毒定位于细胞核内，伪狂犬病病毒可先后定位于细胞核和细胞质，犬瘟热病毒同时定位于细胞质和细胞核，口蹄疫、狂犬病、乙脑病毒只定位于细胞质内等。另外通过免疫组织化学方法，还可明确观察到致病病原在组织培养细胞和机体细胞内的生长增殖动态，即病毒的扩散过程。目前已在兽医病理学诊断中得到应用。
免疫组化诊断技术已列入我国《猪瘟诊断技术》《犬传染性肝炎诊断技术》和《犬瘟热诊断技术》等动物疫病诊断方法的国家标准或行业标准中，但因免疫组化诊断需要高滴度、高特异的一抗，目前尚无相关商品化试剂盒供应，在一些实验室还缺乏病理制片等工作基础，因此限制了其在兽医疫病诊断中的应用。